高倍显微镜观察叶绿体和线粒体

高倍显微镜观察叶绿体和线粒体

实验方案设计

学 院 生命科学学院

专 业 生物科学（师范）

年 级 2009级 5班

小 组 成 员

2011年12月18日

一、实验背景资料

（一）主要背景

本实验来源于新人教版普通高中课程标准实验教材必修1第三章第二节细胞器中的实验——用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体。

中学生物学中与本实验相关的理论知识主要有必修1中第三章——细胞的基本结构内容部分关于叶绿体和线粒体的介绍，同时在后面的第四章、第五章还分别有关于细胞的呼吸作用和植物细胞光合作用的介绍以及必修3中关于生态系统的介绍等，这些知识与本实验都有一定的联系。其中重点是在“细胞内细胞器的分工”中谈到叶绿体是植物细胞的“养料制造车间”和“能量转换站”，线粒体是细胞的动力车间，植物细胞生命活动所需的能量，大约有95％都是来自线粒体。同时关于本部分内容在课堂上老师还可以对叶绿体和线粒体的基本结构、形状和功能做一些补充，如高等植物中叶绿体具有双层膜结构，两膜间没有联系。在叶绿体内部存在复杂的层膜结构，它悬浮于基质中，这些层膜叫做类囊体。类囊体也是双层膜结构，它通常又由几十个垛叠在一起而构成基粒，类囊体膜上有光合作用的色素。在绿色植物和藻类中普遍存在的叶绿体是光合作用场所。同时叶绿体也有自己特有的双链环状DNA，核糖体和进行蛋白质生物合成的酶，能合成出一部分自己所必需的蛋白质，因此科学家认为叶绿体是一种半自主性的细胞器。另外叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞含有的细胞器，所以认为叶绿体是植物细胞的“养料制造车间”和“能量转换站”。而对于线粒体也需要适当的做一些介绍，主要包括线粒体由两层膜包被，外膜平滑，内膜向内折叠形成嵴，为酶提供更多的粘附位点，两层膜之间有腔，线粒体中央是基质。在基质内含有有氧呼吸作用的全部酶类，线粒体能为细胞的生命活动提供场所，是细胞内有氧呼吸和形成ATP的主要场所，所以将其称为细胞的“动力工厂”。另外，线粒体有自身的DNA和遗传体系，因此，科学家线粒体也是一种半自主性的细胞器。另外，在初中的时候学生已经接触过显微镜，知道它的一般使用方法，在之前的实验脂肪的鉴定中也使用过显微镜，学生对显微镜的使用有一些基础，但高倍镜的使用可能不太熟练，这节课着重于高倍镜的使用方法。

课程标准对本实验相关内容的要求如下：1、使用高倍显微镜观察叶绿体、线粒体的形态和分布。2、掌握高倍镜的使用方法和临时装片的制作方法，能在

观察实验中发现问题和提出问题，接受科学方法的训练，培养学生动手能力以及加强学生对细胞微观结构的认识。3、实验过程中，还能培养学生团队精神。其中主要涉及到学生如何正确的使用光学显微镜以及如何制作临时装片和在实验操作中的团队合作三方面内容。同时还对学生的生物学兴趣培养做了一定的要求。

本实验的目的和意义主要让学生学会生物学中的一些基本操作，培养学生动手操作能力以及养成生物科学的一些基本素养，如显微镜的使用，如何观察植物细胞内的一些结构以及临时装片的制作等。同时通过本实验也能学生了解到团队合作的重要。另外在本试验中通过对叶绿体的胞质环流等现象的观察，还能激起学生对生物学知识学习的兴趣爱好。

本实验是在学生学习叶绿体、线粒体等相关知识进行的，便于学生对前面学生知识的理解。同时叶绿体、线粒体是生物细胞的重要细胞器，与生物的多种生命活动有关，对它们的学习便于学生对这些生命现象的理解。另外本实验的学习还为后面章节——细胞物质的输入和输出、光合作用等相关内容的学习打下了基础。而在本章节《细胞质的结构和功能》中主要讲述细胞质基质和细胞器两方面的内容，关于细胞器的内容，则是重点讲述线粒体和叶绿体这两种细胞器，主要说明这两种细胞器在动植物体中存在的部位、在细胞内的分布、基本结构和主要功能。此外，还简要讲述了内质网、核糖体、高尔基体、中心体和液泡这5种细胞器，从而可以看出本实验内容在本章中的重要性。另外本实验是高中生物课程的第三个大实验，是继“观察DNA和RNA在细胞中的分布”实验后又一个观察生物细胞中结构物质的实验，体现生物学作为一门实验科学，学会观察的重要性，同时也可以看出本实验的重要性。

在开展本实验时常见的难题或疑问主要有以下方面：1、学生对显微镜的使用可能存在一定的问题（由于一些学生在初中时还少有机会接触到显微镜，虽然在前两次试验中学生也使用到了显微镜，但对显微镜的操作需要有一定的经验才能熟练地掌握，所以在本次试验中显微镜的熟练使用仍是一个难题）；2、实验的选材（要注意所选材料的必须含有大多的叶绿体，这就提高了选材的难度。同时针对线粒体的选材，因为其在所有真核生物都存在，且主要存在在生长比较旺盛的部位，所以可以思考除了用人口腔上皮细胞外，是否还有更好更方便的材料。）；

3、对于线粒体的观察，除了用健那绿染色外，是否还有其他的更好的染料；4、

如何使本实验成功观察实验结果以及实验过程中的一些细节问题，如叶绿体的观察注意保水，线粒体的观察注意染色程度等；5、本实验的观察可否用其他方式替代，比如直接进行叶绿体、线粒体模型的制作，在进行模拟实验。6、实验的延伸、拓展，除了让学生学会在实验课需要掌握的东西外，是否还可以给他们其他一些启示和引导，比如如何对活细胞中其他的一些结构进行观察等。

（二）相关知识补充

1、叶绿体

（1）叶绿体的结构

叶绿体是绿色植物细胞内进行光合作用的结构，是一种质体。质体有圆形、卵圆形或盘形3种形态。叶绿体含有叶绿素a、b而呈绿色，容易区别於另类两类质体──无色的白色体和黄色到红色的有色体。叶绿素a、b的功能是吸收光能，通过光合作用将光能转变成化学能。叶绿体扁球状，厚约2.5微米，直径约5微米。具双层膜，内有间质，间质中含呈溶解状态的酶和片层。片层由闭合的中空盘状的类囊体垛堆而成，类囊体是形成高能化合物三磷酸腺苷(ATP)所必需。

图一：叶绿体结构

（2）叶绿体的由来

1880年，法国植物学家、植物叶绿体的发现者席姆佩尔证明淀粉是植物光合作用的产物。1883

年，他经研究发现淀粉只在植物细胞的特定部位形成，并

将其命名为叶绿体。

（3）叶绿体与光合作用

叶绿体(chloroplast)是植物细胞所特有的能量转换细胞器，其功能是进行光合作用， 即利用光能同化二氧化碳和水，生成糖，同时产生分子氧。起作用图如下：

图二：光合作用过程图（c3植物）

2、线粒体

（1）线粒体的结构

线粒体是由两层单位膜套叠而成的封闭囊状结构。主要由外膜、内膜、膜间隙和基质4部分组成。外膜平滑，内膜向内折叠形成嵴，两层膜之间即为膜间隙，线粒体中央是基质。其结构如下：

嵴间隙(内室) (外室) 图三：线

粒体结构图

（2）线粒体的发现

1980年，德国科学家Altmann首先在光学显微镜下观察到动物细胞内存在着一种颗粒状的结构，称做生命小体（bioblast）。1987年Benda重复了以上实验，并将之命名为线粒体（mitochondria）。1904年Meves在植物细胞中也发现了线粒体，从而确认线粒体是普遍存在于真核生物所有细胞中的一种重要细胞器。

（3）线粒体与呼吸作用

生物体内的有机物在细胞内经过一系列的氧化分解，最终生成二氧化碳或其他产物，并且释放出能量的总过程，叫做呼吸作用。它包括有氧呼吸和无氧呼吸， 其中有氧呼吸是指细胞在氧的参与下，通过酶的催化作用，把糖类等有机物彻底氧化分解，产生出二氧化碳和水，同时释放出大量能量的过程。它是高等动物和植物进行呼吸作用的主要形式，细胞进行有氧呼吸的主要场所是线粒体。其过程如下图：

图四：呼吸作用过程图（有氧呼吸）

二、实验原理

（一）主要原理

1、叶绿体的观察植物绿色部位的细胞中含有叶绿体。如果将叶片的横切片制成临时装片，就可以在显微镜下观察到叶绿体。某些植物幼嫩的叶也可直接用于观察叶绿体。

2、线粒体的观察线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，内含细胞色素氧化酶系。健那绿是一种碱性染料,可以专一性地对线粒体进行染色。与线粒体内的细胞色素氧化酶系发生作用时，染料始终保持氧化状态,呈蓝绿色;而线粒体周围的

细胞质中的染料被还原为无色的状态。通过染色可以在高倍显微镜下观察到呈现蓝绿色的线粒体。

（二）知识介绍

1、光学显微镜

（1）显微镜的介绍

显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，是人类进入原子时代的标志。主要用于放大微小物体成为人的肉眼所能看到的仪器。显微镜分光学显微镜和电子显微镜：光学显微镜是在1590年由荷兰的杨森父子所首创。现在的光学显微镜可把物体放大1600倍，分辨的最小极限达0.1微米。在本次试验中我们将使用到光学显微镜，它通常由光学部分、照明部分和机械三部分组成，它的具体构造如下图：

图五：光学显微镜构造图

（2）显微镜的使用方法

a.对光：

(a)将低倍镜转至镜筒下方与镜筒成一直线。

(b)拨动反光镜，调节至视野最亮无阴影。反光镜有平、凹两面，光源强时用平面，较暗时用凹面，需要强光时，将聚光器提高，光圈放大；需要弱光时，将聚光器降低，或光圈适当缩小。

(c)将待观察的标本置载物台上，转动粗调节器使镜筒下降至接物镜接近标本。于转动粗调节器的同时，须俯身在镜旁仔细观察接物镜与标本之间的距离。 (d)左眼于接目镜观察，同时左手转动粗调节，使镜筒徐徐上升以调节焦距，使视野内的物象看到上时即停，再调微调节器，至标本清晰为止。

b.接物镜的使用及光线的调节：显微镜一般具有三个接物镜，即低倍、高倍及油镜，固定于接物镜转换盘孔中。观察标本时，先使用低倍接物镜，此时，视野较大，标本较易查出，但放大倍数较小（一般放大100倍），较小的物体不易观察其结构。高倍接物镜放大的倍数较大（一般放大400倍），能观察微小的物体或结构。寄生虫的蠕虫卵，微丝蚴，原虫的滋养体及包囊，昆虫的幼虫，均使用低、高倍镜。组织细胞内的原虫，则使用油镜。使用低、高倍镜观察，如在低倍镜下不能准确鉴定所见的物体或其内部构造时，则转高倍镜观察。使用油镜观察，一般加一滴油后直接将油镜头浸入油滴中进行镜检观察。

c.低倍、高倍、油镜头的识别：

(a)标明放大倍数10×，40×，100×，或10/0.25，40/0.65，100/1.30。 (b)低倍镜最短，高倍镜较长，油镜最长。

(c)镜头前面的镜孔低倍镜最大，高倍镜较大，油镜最小。

(d)油镜头上常刻有黑色环圈，或“油”字。

d.低倍镜换高倍镜的使用方法：

(a)光线对好后，移动推进器寻找需要观察的标本。

(b)如标本的体积较大，不能清楚查见其构造因而不能确认时，则将标本移至视野中央，再旋转高倍接物镜于镜筒下方。

(c)旋转微调节器至物象清晰为止。

(d)调节聚光器及光圈，使视野内的物象达到最清晰的程度。

2、健那绿

健那绿，即Janus green B 染液，原来也曾译为詹纳斯绿 B，常用作线粒体

专一性活体染色剂。 中文别名健那绿 、詹纳斯绿、双氮嗪绿、 苏铁木精，英

图六：健那绿

文别名为Janus green，Diazine green，Diazine green S 。分子式C30H31ClN6 分子量511.07。其原理为线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。配方见实验药品介绍，其主要用途为专一性线粒体的活细胞染料，可使线粒体呈现蓝绿色，而细胞质接近无色，以在高倍显微镜下观察线粒体分布和形态。

3.黑藻

图七：黑藻

黑藻俗称温丝草、灯笼薇、转转薇等，属水鳖科、黑藻属单子叶多年生沉水

植物。茎圆柱形，表面具有纵向细棱纹，质较脆。休眠芽长卵圆形；苞叶多

数，螺旋状紧密排列，白色或淡黄绿色，狭披针形至披针形。叶3～8片轮生，常具紫红色或黑色小斑点，先端锐尖，边缘锯齿明显，无柄，具腋生小鳞片；主脉1 条，明显。花单性，雌雄同株或异株腋生无柄雄佛焰苞近球形，绿色，表面具明显的纵棱纹，顶端具刺凸；雄花萼片、花瓣各3片，白色。果实圆柱形，表面常有2～9个刺状凸起。种子2～6粒，褐色，两端尖。花果期5～10月。

黑藻茎直立细长，长50-80厘米，叶带状披针形，4-8片轮生，通常以4-6片为多，长1.5厘米左右，宽约1.5-2cm。叶缘具小锯齿，叶无柄。广布于池塘、湖泊和水沟中。在中国南北各省及欧、亚、非和大洋洲等广大地区均有分布。

黑藻喜阳光充足的环境。环境荫蔽植株生长受阻，新叶叶色变淡，老叶逐渐死亡。最好让它每天接受2～3个小时的散射日光。性喜温暖，耐寒，在15～30℃的温度范围内生长良好，越冬不低于 4℃。

适宜浅水绿化、室内水体绿化，作水下植被，可盆栽、缸栽，是装饰水族箱的良好材料，常作为中景、背景使用。是良好的沉水观赏植物。

三、实验材料及器具

（一）材料：

1、新鲜的黑藻的叶

选材原因：黑藻叶片细胞层少，嫩叶只有一层细胞，便于观察叶绿体的形态和分布，黑藻比较常见，便于取材。选材时注意选择新鲜的富含叶绿体的嫩叶。实验前用清水浸泡即可。

2、人口腔上皮细胞

选材原因：真核细胞内一般都存在线粒体，选用人的口腔细胞一是方便，能引起同学的兴趣，而是排除植物细胞叶绿体的干扰。取材时只用牙签轻轻刮下口腔内壁，注意不要刮破。

（二）实验药品

1、新配制的质量分数为1%的健那绿染液，

（1）选材原因：健那绿染液是专一性染线粒体的活细胞染料，线粒体中细胞色

素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布。

（2）配置方法：取健那绿0.5g+生理盐水50ml，加热到30~40℃，使其充分溶解。注：此染液宜新鲜配置，以保持被氧化的能力。 2、蒸馏水（叶绿体观察时湿润作用） 3、生理盐水（保持口腔上皮细胞的活性）

（三）实验仪器

1、主要器具

光学显微镜（用于叶绿体、线粒体显微观察）；

载玻片、盖玻片（含叶绿体、线粒体材料临时装片制作）；

滴管、镊子、吸水纸（湿润叶绿体材料、材料的撕取、临时装片制作后的吸水等）； 消毒的牙签（刮取人的口腔上皮细胞）。 2、光学显微镜的成像原理：

（1）物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像A'B'。 A'B'靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像A''B''后供眼睛观察。眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。

图八：光学显微镜成像原理图

（2）高倍显微镜的使用方法： a.低倍镜下，把物象移至视野中央。 b.转动转换器更换高倍物镜。 c.调整光源或遮光器使视野亮度适宜。 d.再转动细准焦螺旋至标本物象清晰为止。

注：视野中物像与标本移动的关系：如视野中某观察对象位于左下方如何移到中央，应将装片或切片向左下方移动（同向移动）。原因是视野中物像移动的方向或切片移动的方向相反。 （3）显微镜使用注意事项

①显微镜在从木箱中取出或装箱时，右手紧握镜臂，左手稳托镜座，轻轻取出，不要只用一只手提取，以防显微镜坠落，然后轻轻放在实习台上或装 入木箱内； ②显微镜放到实习台上时，先放镜座的一端，再将镜座全部放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震动过大，透镜和微调节器的装置易损坏； ③显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。如透镜部分不洁时，用擦镜纸轻擦，如有油污，先将擦镜纸蘸少许二甲苯拭去； ④显微镜不能在阳光下暴晒和使用；

⑤接目镜和接物镜不要随便抽出和卸下必须抽取接目镜时，须将镜筒上口净用布遮盖，避免灰尘落入镜筒内，更换接物镜时，卸下后应倒置在清洁的台面下，并随即装入木箱的置放接物镜的管内；

⑥显微镜用完后，取下标本片，经聚光器降下，再将物镜转成“八”字形，转动粗调节器使镜筒下降，以免接物镜与聚光器相碰； ⑦显微镜应放在干燥的地方，以防生霉。

⑧按照正确的观察顺序，先用低倍镜找到观察的物像，通过移动临时装片选择单层的典型细胞，再转换高倍镜进行观察。

⑨利用自然光源镜检时，最好用朝北的光源，不宜采用直射阳光；利用人工光源时，宜用日光灯的光源。注意通过调整光圈来调节反射光线的强弱，使进入物镜的光线不要太强。

⑩镜检时载物台不可倾斜，因为当在五套载物台倾斜时，液体或油易流出，既损

坏了标本，又污染载物台，也影响检查结果

四、实验步骤

（一）实验材料准备

制片之前30min，将黑藻放于40 °C的水中浸泡，最主要是浸泡其叶；并配制健那绿染液保持在37°C保存。

（二）临时装片制备

1、叶绿体装片

在洁净载玻片中央滴一滴清水。用镊子夹起一片黑藻叶片，撕取小片放入水滴中，盖上载玻片。 2、线粒体装片

（1）染色 在洁净载玻片中央滴一滴健那绿染液。用凉开水漱口3~4次，用消毒牙签宽头在自己漱净的口腔内壁上轻轻地刮几下，把牙签上附有碎屑的一端，放在染液中涂几下，放置8~10min。时间到了以后盖上盖玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干。

（2）洗脱 将载玻片平放在实验台上(防止因盖玻片滑动造成细胞折叠而影响观察)，在载玻片的一端逐滴滴加生理盐水，在另一端用吸水纸吸取液体，重复2～3次，即可洗去多余的染液。

（三）镜检观察

将显微镜调光聚焦之后，先用低倍镜找到要观察的细胞，再换用高倍镜观察。

五、注意事项

1.制备和镜检叶绿体装片时，临时装片中的叶片不能放干了，要随时保持有水状态。

2.在用牙签取口腔上皮细胞时要注意像一个方向刮，不要来回滑动。 3.在用牙签取口腔上皮细胞时要注意使用的力度，注意别将自己口腔划伤。 4.染色期间要防止装片干燥，必要时刻滴加染液。染色时间不宜过长8-10min.

六、替代的实验方法

七、 思考题

1、叶绿体的形态和分布，与叶绿体的功能有什么关系？

（1）叶绿体呈椭球形或球行，可以减少运动时的阻力，有利于它的运动； （2）叶绿体在细胞质中散乱的分布，相互不重叠，有利于每一个叶绿体都充分接受光照；

（3）在不同的光照条件下，叶绿体可以运动，改变椭球体的方向，这样既能接受较多的光照，又不至于被强光灼伤。在强光下，叶绿体以其椭球形的侧面朝向光源，在弱光下，叶绿体以其椭球形的正面朝向光源。因此，在不同光照条件下黑藻叶内的叶绿体椭球形形状不完全一样。

2、观察线粒体的实验中，为什么用新鲜的健那绿染液给活细胞染色，且染色时间不宜过长？

（1）健那绿染液浓度不宜过高，染色时间不宜过长，否则细胞质会重新氧化成有色状态而不能是充分还原染料成无色状态； （2）健那绿不可久存，染液宜在使用时配置新鲜液；

（3）活细胞的线粒体可以被染色，细胞死亡后，蓝绿色就会褪去。 3、为什么观察叶绿体的临时装片，实验过程中要始终保持有水状态？ 防止细胞内的叶绿体失水。如果叶绿体失水，叶绿体就缩成一团，无法观察叶绿体的形态分布。

八、用品清单

我们计划班级有40人，分成5个大组，每组8个人，又每2个人组成一个小组，制作一组装片（叶绿体+线粒体）。