脂质体转染Protocol
脂质体转染Protocol
【实验原理】
脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层。阳离子脂质体表面带正电荷，既能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体，其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。脂质体本身具有细胞毒性，但鉴于其转染的高效性，脂质体仍是目前常用的转基因方法之一。
【实验仪器】
仪器名称 CO2 培养箱 离心机 荧光显微镜 超净工作台 电动移液枪 微量移液枪 血球计数板
生产厂商 Thermo Eppendorf Olympus AIRTECH 大龙 Eppendorf
仪器型号
SERIES II WATER JACKET
Centrifuge 5702
IX51 SW-CJ-2FD
【实验试剂】
完全培养基（Gibco），胰酶（Gibco），PBS，Opti-MEM（Gibco），Lipofectamine 2000（Invitrogen），pCMV-EGFP
【实验用品】
75%乙醇，酒精灯，移液管，微量枪头，EP管，24孔板，废液缸
正 德 利 用 厚 生 惟 和
【操作前注意事项】
(一) 所有的细胞操作均需要注意无菌操作；
(二) Lipofectamine 2000在使用之前要短暂离心一下，保证盖子上的液体离心到
管中，避免污染；
(三) 24孔板中细胞实验时汇合度达到80 %~90 %，且细胞分布均匀。
【实验步骤】
(一) 准备细胞：提前一天取对数生长期的细胞消化后接种在24孔板里，保证第
二天细胞的汇合度达到80 %~90 %，实验当天提前观察细胞汇合度达到80 %~90 %，即可开展后续实验；
(二) 打开超净工作台，准备好Opti-MEM，质粒DNA和Lipofectamine 2000； (三) 准备12个EP 管，分别用Opti-MEM稀释质粒DNA和Lipofectamine 2000
为50μl；
质粒DNA和Lipofectamine 2000比例及用量表
(四) 稀释好的脂质体室温孵育5 min；
正 德 利 用 厚 生 惟 和
(五) 将稀释好的脂质体加入稀释好的质粒中（20 min内完成），轻轻混匀后室温
孵育20 min；
(六) 用300 μl Opti-MEM清洗细胞两次，洗完后在Mock组中加入500 μl
Opti-MEM，实验组中分别加入400 μl Opti-MEM；
(七) 将上述脂质体与质粒混合物（100 µl）以“弓”字形依次加入实验组的细胞中，
轻轻摇匀，放入CO2培养箱中； (八) 4~6 h后换成完全培养基培养； (九) 转染后24 h和48 h观察并拍照。
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