过氧化物酶
三、过氧化物酶活性的测定
过氧化物酶通过催化酚类物质与H2O2反应生成醌类来清除植物体内的H2O2.过氧化物酶还与生长素、NADH、NADPH的氧化有关,在植物代谢中起着重要作用。
实验前思考
1、POD和CAT清除H2O2的反应有何不同
2、植物体内有哪些主要的过氧化物酶?
原理
愈创木酚(邻甲基苯酚)可作为过氧化物酶的底物,与H2O2反应生成茶褐色产物。该物质在470nm处有最大吸收峰,故可以分光光度计测定过氧化物酶的活性。
材料、仪器与试剂
1、材料
马铃薯块茎或其他植物组织材料
2、仪器及用具
紫外分光光度计;离心机;研钵;5ml量筒;25ml容量瓶;微量进样器;秒表。
3、试剂
(1)50mmol·l-1ph值为5.5的磷酸缓冲液。
(2)50mmol·l-1愈创木酚溶液;称取6.207g愈创木酚,用少许酒精溶解,然后定容至1000ml。
(3)2% H2O2;取30% H2O267ml,加水至100ml。
方法与步骤
1、酶液的提取
取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎,切碎至于研钵中,加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆,将匀浆全部转入离心管中,以3000g离心10min,上清液转入25ml容量瓶。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取两次,上清液并入容量瓶,定容至25min,低温下保存备用。
2、过氧化物酶活性测定
酶活性测定的反应体系包括:2.9ml50 mmol·l-1磷酸缓冲溶液,1ml2%HO,1ml50mmol·l-1愈创木酚溶液和0.1ml酶液。取2支试管分别加入上述各溶液,1支于沸水中5min作为对照,另1支于37℃水浴中保温15min。反应结束后立即利用分光光度计检测其在470nm波长下的吸光度,测定3~5min的吸光度变化。
结果与计算
以每分钟内的△A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位。
过氧化物酶活性(u·g-1·min-1)=△A470V÷0.01WtVt
式中:△A470:反应时间内吸光度的变化;
W为材料鲜重(g)
V为酶提取液总量(ml);
Vt为反应系统中加入的酶液量(ml);
t为反应时间(min)。
试验后思考题
1、在此实验中△A470反应时间如何掌握?
2、使用愈创木酚溶液时要注意什么?为什么?