植物基因组DNA提取

　　[摘  要]DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，因此DNA的提取液是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作之一。基因组DNA提取应保证核酸一级结构的完整性并且排除其他分子的污染，使下游实验顺利进行。不同植物的组成成分不同，同一植物个体的不同发育时期其组织细胞中的组成成分也不同，需要根据具体情况选择适宜的提取方法。

　　[关键词]基因组，DNA，提取

　　中图分类号：TD327.3 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）24-0261-01

　　基因组（Genome）是一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。说的更确切些，核基因组是单倍体细胞核内的全部 DNA分子。线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子。叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子。

　　基因组DNA提取应保证核酸一级结构的完整性，因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核算结构与功能研究的基础;应排除其他分子如蛋白、多糖、脂类、有机溶剂等的污染，使下游实验顺利进行。植物多样性丰富，不同植物中的水分、多糖和酚类物质含量差别较大，尤其是植物组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR反应等实验有较大的影响，提取时应注意去除。因为植物组织细胞内外的组成成分复杂多样，所以使得植物基因组DNA的提取相对于动物等其他生物材料来说更为繁琐、困难。不同植物的组成成分不同，同一植物个体的不同发育时期的组织细胞中的组成成分也不同，需要根据具体情况选择适宜的提取方法。常用的制备植物基因组的方法有很多，常用到的方法有CTAB法等;对于植物基因组DNA的分离纯化可以选择已经商品化的试剂盒（本实验采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒）。

　　目前，以人类基因组课题为契机，发达国家及部分发展中国家均在不遗余力地推进基因组科学的发展。对某些原生动物和真菌等小型基因组的分析已经取得重大突破，整个研究领域正迎来后基因组科学（post-genome？science）时代。然而，植物基因组分析特别

　　是木本植物基因组分析起步较晚，现阶段主要还是围绕拟南芥（Arabidopsis？thaliana）、水稻（Oryza？sativa）和玉米（Zea？mays）等草本模式植物展开。

　　1 实验材料

　　植物种类繁多，一般情况下选用健康的嫩叶（或幼芽）为宜。健康的嫩叶（或幼芽）不仅含有较少的代谢产物，而且细胞数量更多。通常情况下，在采集健康的嫩叶（或幼芽）之前将植物置于暗处一日为宜，这样可以有效地减少代谢产物的产生。如果所采集的植物材料不能立刻用于基因组DNA提取实验，可以将样品保存于4℃冰箱中24h，超过24h时应置于-80℃中保存。注意样品应避免反复冻融，以防止提取的DNA讲解。

　　2 实验试剂及器材

　　植物基因组DNA提取试剂盒、液氮、β-巯基乙醇、苯酚、氯仿、无水乙醇

　　研钵（需预冷）、移液器、1.5mL离心管（需灭菌）、低温高速离心机、恒温水浴锅、4℃冰箱、-80℃冰箱、电泳仪

　　3 操作步骤

　　①取健康的植物嫩叶（或幼芽）适量（约0.1g）置研钵中，于加入液氮迅速充分研磨至粉末状。

　　②将研磨成粉末的样品加到700uL 65℃预热缓冲液GP1（预先加入β-巯基乙醇）的离心管中，65℃水浴20min。

　　③加入700uL氯仿，充分混合均匀，置于低温高速离心机中，4℃、10000rpm下离心5min。

　　④将上层水相（约取400uL）转入一个新的离心管中，加入700uL缓冲液GP2，充分混合均匀。

　　⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3中，4℃、10000rpm离心30s，低调废液。

　　⑥加入500uL去蛋白液GD，13000rpm离心30s，弃掉废液。

　　⑦加入700uL漂洗液GW，13000rpm离心30s，弃掉废液。

　　⑧加入500uL漂洗液GW，13000rpm离心30s，弃掉废液。

　　⑨ 再次13000rpm离心2分钟，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟。

　　⑩将吸附柱转入干净离心管中，加50-200uL（干重组织加30-50uL）洗脱缓冲液TE室温置于2-5min，12000rpm离心30s。

　　11离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2min，13000rpm离心2min，即可得到高质量植物基因组DNA。

　　4 基因组DNA提取常见问题

　　①基因组DNA的得率较低或无基因组DNA

　　②提取的基因组DNA有降解

　　③提取的基因组DNA中有RNA的污染

　　④提取的基因组DNA不能顺利进行后续实验

　　5 紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度

　　DNA在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50ug/mL双链DNA。一般用OD260/OD280值检测DNA样品的纯度：正常OD260/OD280值约为1.7-1.9，说明DNA纯度较好;小于1.7可能有蛋白质污染;大于2.0，说明有RNA污染或者DNA已经降解。注意：因为pH值和离子会影响光吸收值，因此注意洗脱时不适用洗脱缓冲液，而使用去离子水，OD260/OD280值可能会略微偏低，但并不表示纯度低。

　　参考文献

　　[1] 李金璐，王硕，于婧，王玲，周世良.一种改良的植物DNA提取方法.植物学报，2013，48（1）：72-78.

　　[2] 迟婧，耿丽丽，高继国，束长龙，张杰.植物叶片基因组DNA快速提取方法.生物技术通报，2014，9：51-57.

　　[3] 陈昆松，李方，徐昌杰，张上隆，傅承新.改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取.遗传，2004，26（4）：529-531.

　　[4] 陈建军，王瑛.植物基因组大小进化的研究进展.遗传，2009，31（5）：464-470.