培养基的制备
一、 培养基的制备:
(一) 液体培养基
1、称量 用电子天平称量配制培养基所需的各种药品:牛肉膏3.0 g 蛋白胨10 g 氯化钠5.0 g
2、溶化 将称好的药品置于烧杯中, 加入少量蒸馏水, 用玻璃棒搅拌, 加热溶解
3、定容 待全部药品溶解后, 加水至所需体积1000ml
4、调pH 用剪刀剪出一小段pH 试纸, 然后用镊子夹取此段pH 试纸, 在培养基中蘸一下, 观看其pH 范围,直至将pH 调制
7.2-7.4
5、过滤
6、分装 将配好的液体培养基分别装入锥形瓶中, 并加塞包扎
7、灭菌 将加塞包扎好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中, 在121℃下灭菌20min.
8、保存 将配置好的培养基放入4℃的冰箱中,保存备用
(二)固体培养基
1、称量 用电子天平称量配制培养基所需的各种药品:牛肉膏3.0 g 蛋白胨10 g 氯化钠5.0 g 琼脂粉15 g
2、除无需过滤外,其余步骤同液体培养基
二、供试样品处理
1. 苔藓植物提取液制备
将采集来的苔藓样品用自来水冲洗,再用去离子水洗净,
放入培养箱于 50℃ 恒温条件下烘干,用电动粉碎机将植物体粉碎。称取 2.0 g 样品粉末,置于具橡胶塞的三角瓶中,加20 ml 无水乙醇, 在摇床上振荡提取20 h, 以1500 r/ min 离心10 min, 收集上清液, 将残渣再用无水乙醇重复提取 2次, 方法同上,合并3次的提取液于小烧杯中, 置 4℃冰箱保存备用。
2. 苔藓植物浸出液的制备
分别将植物体洗净, 蒸馏水浸泡至吸水饱和, 然后用滤纸吸去体表多余水分, 但不能过重挤压。称取8 g藓体, 加少许蒸馏水, 研磨成浆状, 再加水至40ml 。放入50℃恒温水浴锅12 h。取出并离心去渣, 得上清液即为浸出液。
三、 菌悬液的制备
取供试细菌菌株,用接种环各取菌苔少许接种至牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上,在 37℃ 恒温培养箱中培养20 h 活化,然后将活化后的菌株接一环于 5 mL 液体培养基中,在恒温振荡器中 37℃ 下培养6- 8 h ,即制成菌悬液。
四、 滤纸片法测定抑菌作用
取直径12 mm 的灭菌滤纸片放入上述苔藓植物提取液中浸泡过夜,将菌悬液各取 0.5 mL 与相应的固体培养基制成含菌平板,用无菌镊子取含浸出液的滤纸片贴在含菌平板上,每皿贴4 片,每菌做 3 次重复,且用无水乙醇浸泡滤纸片作空白对照,置于 37℃ 恒温培养箱中培养 24 h 后,
取出测定抑菌圈直径大小,比较抑菌效果。(每种细菌10ml 菌悬液,4种细菌)(61个培养皿)
五、分光光度法测定抑菌效果
将配制好并灭菌后的液体培养基,按每管准确量取 4 mL 在无菌操作台处分装于已灭菌试管。 准确量取4 mL 供试苔藓植物浸出液加入上述试管中,每支试管接 1 种供试细菌(菌悬液) 。 另取 1支试管不接任何菌作对照。 置于 37℃ 恒温振荡培养箱中培养 12 h 后, 在紫外可见分光光度计 650 nm 下比色测定, 3次重复。 另取 2支加有4 mL 液体培养基的试管,各加入 4mL 的无水乙醇,其中 1支试管接入供试细菌,作为含菌对照,在同样条件下培养 12 h 后,进行比色测定。(总试管66+6=72支)