细菌生物膜研究进展(1)
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抗生素的合理应用
细菌生物膜研究进展
郑波
[关键词] 生物膜（Biofilms）；抗药性，细菌（Drug Resistance，Bacterial）
1 生物膜的概念
细菌生物膜是指在多聚糖、蛋白质和核酸等组成的基质内相互粘连粘附于物体表面的细菌群体[1]。生物膜可以由一种或几种细菌混合生长而成。乳酸乳球菌与萤光假单胞菌混合形成的生物膜就是一个典型的例子。乳酸乳球菌自身不易形成生物膜，但可以提供给萤光假单胞菌乳酸作为养料，而萤光假单胞菌帮助乳酸乳球菌固定在物体表面，并且消耗氧气为乳酸乳球菌这一厌氧菌提供更合适的生长环境[2]。
生物膜的生命周期分为附着、生长和分离3部分。附着阶段，物体表面的血清蛋白和其他物质作为连接物介导细菌的附着；生长阶段，细菌通过分裂并在物体表面定植，生成聚合物基质，使得生物膜形成三维结构，并形成隧道，这些隧道帮助营养物质的交换以及废物的排出，并调节生物膜内的pH值。生物膜中的细菌对氧气和营养的需要有所减少，废物通过其内的管道得以排出。生物膜内细菌间的紧密接触为携带耐药基因的质粒的交换和对密度感应分子的交流提供了良好环境。生物膜内的细菌间更利于质粒、酶和其他分子的交换，通过化学信号进行交流。生物膜的形成需要细菌间的化学信号进行协调。使得细菌能感知到周围细菌的存在并对环境变化作出相应的反应。这一过程称为密度感应（quorum-sensing）。虽然不同细菌的生物膜有其特异性，但均具有一些普遍的结构特征。生物膜中细菌形成的微菌落间具有间隙空位（interstitial voids），液体可在这些间隙中流动，使得营养物质、气体和抗菌药物得以扩散。生物膜的结构随着外部和内部的改变而持续变化。
的患者鼻窦中存在生物膜，这些患者主要为铜绿假单胞菌感染。Ramadan等[6]于2005年对5位慢性鼻窦炎患者进行黏膜活检，对标本进行扫面电镜检查均发现有生物膜的存在。此外，生物膜已被证实与下列感染有关：慢性前列腺炎、导管相关感染、人工关节感染、牙周病、心内膜炎以及囊性纤维化患者的假单胞菌肺炎等。
3 生物膜与抗菌药物耐药
生物膜内细菌对抗菌药物的敏感性较游离状态时显著降低，最低可降低1000倍。其原因包括生物膜的结构阻止了药物的传输或生物膜中的细菌的生理学改变等。以前一直认为生物膜介导的对抗菌药物耐药的原因是抗菌药物难以渗透入生物膜。但一些研究否认了这一假设。研究显示喹诺酮类可以很快的渗透到铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌生物膜的深部[7，8]，四环素可很快的渗透到大肠埃希菌生物膜内，万古霉素可以很快渗透到表皮葡萄球菌生物膜内。目前唯一得到证实的是氨基糖苷类药物，由于生物膜中的基质带负电荷，而氨基糖苷类带有正电荷，因此氨基糖苷类药物难以渗透到生物膜的深部[9]。
生物膜对β内酰胺类耐药性增加的机制之一是细菌产生的β内酰胺酶在生物膜表面基质内聚集，可达到很高的浓度，能迅速的将渗透进生物膜内的β内酰胺类抗生素水解掉，有效保护深部细菌不被β-内酰胺类抗菌药物灭活[10]。有研究证实氨苄西林会被肺炎克雷白杆菌生物膜表层中聚集的β内酰胺酶快速水解。
生物膜造成的缺氧环境也增加了对抗菌药物耐药性。一项在囊性纤维化患者生成的铜绿假单胞菌生物膜的研究显示氧气仅能渗透到生物膜的25%深度。铜绿假单胞菌在厌氧条件下比在有氧条件下对抗菌药物的敏感性明显降低[11]。
由于很多抗菌药物对繁殖期细菌杀伤作用更强大，如青霉素类、头孢菌素类和碳氢霉烯类等。在生物膜深部的细菌受氧气、营养物质缺乏的影响及可能存在的密度感应系统的调控，使得细菌的生长、繁殖速度下降，影响抗菌药物对其作用。因此在抗菌药物作用下，生物膜中相对敏感的细菌会被杀死，但耐药菌会持
2 生物膜与临床
99%的细菌以生物膜的形式生活，美国疾病控制与预防中心估计至少65%的人类细菌感染与生物膜有关[3]。生物膜已经被证实与慢性中耳炎、中耳胆脂瘤、慢性腺样体炎[1]等疾病相关。Pawlowski等[4]于2005年在耳蜗植入体上发现了细菌生物膜。Cryer等[5]于2004年发现一些慢性鼻窦炎手术治疗后症状仍持续
郑波
北京大学第一医院临床药理研究所，北京 100034
广东人，副教授，副主任医师，主要从事细菌耐药机制和抗菌药物合理应用的研究工作。Email：[email protected]
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续存在，而一旦抗菌药物停止使用后，这些耐药菌会重新繁殖、生长。
生物膜形成后特殊基因的表达也是生物膜对抗菌药物耐药的一个原因。如生物膜中的细菌在与β内酰胺类长时间接触后，其编码β内酰胺酶的基因大量表达，β内酰胺酶产生显著增多，增强生物膜中细菌对β内酰胺类抗菌药物的耐药性。铜绿假单胞菌的ndvB基因编码外周胞质葡聚糖，该基因仅在生物膜形成后表达，大量生成的葡聚糖限制了妥布霉素在铜绿假单胞菌生物膜中的渗透，导致妥布霉素无法作用于生物膜深部的细菌[12]。
的类金刚石沉着在聚氨酯表面的模型具有对微生物黏附和内壁结垢的抵抗作用。总的来说，聚氨酯上镀制越薄、光折射率越低的无定形类金刚石保护膜，将成为一种越有力的抗菌黏附生物材料[16]。
5 生物膜的清除
虽然生物膜中的细菌对抗菌药物的敏感性有不同程度的下降，但还是有一些抗菌药物对特定细菌形成的生物膜有一定的清除作用。流感嗜血杆菌是慢性鼻窦炎的重要病原菌，一项体外研究显示环丙沙星和头孢克肟对游离状态的流感嗜血杆菌均有很好的抗菌活性，但对于形成生物膜的流感嗜血杆菌，环丙沙星对大多数菌形成的生物膜具有很好的清除作用，而头孢克肟却无活性。此外，利福平和环丙沙星联合能更有效清除流感嗜血杆菌生物膜[17]。对于凝固酶阴性葡萄球菌中的路邓葡萄球菌生物膜，莫西沙星显示出非常好的清除生物膜能力，生物膜杀菌浓度90（biofilm bactericidal concentrations，BBC90）仅为2 μg/mL，远低于利奈唑胺（BBC90>128 μg/mL）、四环素（BBC90 128 μg/mL）、达托霉素（BBC90 128 μg/mL）和万古霉素（BBC90>128 μg/mL）[18]。密度感应系统抑制剂不但能抑制生物膜形成，还能用于清除已形成的生物膜。RIP可增强万古霉素、环丙沙星或亚胺培南对金黄色葡萄球菌生物膜的作用[19]。采用一些物理手段如超声波、电磁波、电流等可增强抗菌药物对生物膜的清除作用[20]。电流可增强氨基糖苷类、喹诺酮类对游离状态的铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、格氏链球菌的杀菌作用。2000 mA的电流可增强万古霉素对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌生物膜的形成，200或2000 mA的电流可协同达托霉素和红霉素增强对表皮葡萄球菌生物膜的清除作用[21]。
一项研究将来自慢性鼻窦炎的的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在体外进行生物膜培养，通过采用流动水冲洗去除盐分，生物膜中的细菌数量明显减少。采用一种类似肥皂水的表面活性剂和钙离子螯合物，无需用冲洗亦可明显减少细菌数量[22]。
生物膜在感染尤其是慢性感染中的作用已越来越多的受到重视，随着人们对生物膜形成机制及耐药机制研究的不断深入，以及人们对包括抗菌药物在内的不同物质对不同细菌生物膜的抑制能力的认识，我们会更好的开发和使用相应措施减少生物膜造成的危害。
4 防止生物膜形成的措施
为防止生物膜的形成，人们进行了大量研究，发现以下这些措施通过降低细菌粘附或使用具有杀菌作用的材料可能预防生物膜的形成。①有研究显示在含金薄膜上合成以三甘醇（triethylene glycol，TEG）结尾的单层直链硫醇可明显抑制大肠埃希菌生物膜的形成。这一现象可能是接触面的溶剂结构、TEG的化学排斥性质和TEG 抑制细菌的动力等多因素作用的结果[13]。②2-甲基丙烯酰羟乙基磷酰胆碱（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcho line，MPC）聚合膜是由MPC与其他乙烯基化合物聚合而得，侧链上含有类似细胞膜结构的磷脂极性基团，所以具有优良生物相容性，已广泛应用于血液透析、人造器官、膜充氧器和一次性临床设备等生物医学领域。Kiyohisa等[14]将包被PMB（MPC-co-n-butyl methacrylate）的不锈钢板和未包被的钢板分别置于含金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌的培养液中温育，发现实验组较对照组未形成生物被膜，分别使用头孢唑啉、庆大霉素后，对照组细菌的数目没有显著地减少，而实验组细菌的数目显著地减少。③金黄色葡萄球菌RNAIII（一种sRNA）已经被证实作用于多个毒力相关基因参与调控金黄色葡萄球菌的致病性。RIP （RNAIII-inhibiting peptide）是一种通过干扰密度感应系统来阻止金黄色葡萄球菌生物膜形成的七肽。将其包被在输尿管内支架并植入鼠的膀胱，可抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，且对替考拉宁具有增效作用[15]。④在生物材料中加入抗菌药物也可抑制表面生物膜的形成。用铸模的方法在形成硅胶的前提中加入利福平，可明显抑制硅胶表面表皮葡萄球菌定植和生长。⑤有实验证实了光折射率为1.7～1.9、厚度为100～600 nm的无定形
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（收稿日期：2009-10-10）
编辑 王琪 赵黎明
本栏目由拜耳先灵医药协办
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