酶反应动力学研究试验技术
酶反应动力学研究试验技术
酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量
1． 底物浓度对反应速度的影响
⑴ 物对酶促反应的饱和现象：由实验观察到，在酶浓度不变时，不同的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线，即当底物浓度较低时，反应速度的增加与底物浓度的增加成正比（一级反应）；此后，随底物浓度的增加，反应速度的增加量逐渐减少（混合级反应）；最后，当底物浓度增加到一定量时，反应速度达到一最大值，不再随底物浓度的增加而增加（零级反应）。
⑵米氏方程及米氏常数：根据上述实验结果，Michaelis&Menten于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即米氏方程：ν= Vmax[S]/(Km+[S])。其中，Vmax 为最大反应速度，Km 为米氏常数。 ⑶Km 和Vmax 的意义： ①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km 等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。 ②当k-1>>k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km 可以反映酶与底物亲和力的大小，即Km 值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，
则越小。 ③Km 可用于判断反应级数：当[S]100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当0.01Km
4．pH 对反应速度的影响：观察pH 对酶促反应速度的影响，通常为一钟形曲线，即pH 过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pH 值就称为酶的最适pH 。人体内大多数酶的最适pH 在6.5～8.0之间。酶的最适pH 不是酶的特征性数 5．抑制剂对反应速度的影响： 凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂。按照抑制剂的抑制作用，可将其分为不可逆抑制作用和可逆抑制作用两大类。 ⑴不可逆抑制作用： 抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。如果以ν～[E]作图，就可得到一组斜率相同的平行线，随抑制剂浓度的增加而平行向右移动。酶的不可逆抑制作用包括专一性抑制（如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和非专一性抑制（如路易斯气对巯基酶的抑制）两种。 ⑵可逆抑制作用： 抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。如果以ν～[E]作图，可得到一组随抑制剂浓度增加而斜率降低的直线。可逆抑制作用包括竞争性、反竞争性和非竞争性抑制几种类型。 ①竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，这种作用就称为竞争性抑制作用。其特点为：a. 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；b. 抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合
部位相同；c. 抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d. 动力学参数：Km 值增大，Vm 值不变。典型的例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶（底物为琥珀酸）的竞争性抑制和磺胺类药物（对氨基苯磺酰胺）对二氢叶酸合成酶（底物为对氨基苯甲酸）的竞争性抑制。 ②反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES 复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。其特点为：a. 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；b. 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；c. 动力学参数：Km 减小，Vm 降低。 ③非竞争性抑制：抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES 复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。其特点为：a. 底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；b. 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；c. 动力学参数：Km 值不变，Vm 值降低。 6．激活剂对反应速度的影响：能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。酶的激活剂大多数是金属离子，如K+、Mg2+、Mn2+等，唾液淀粉酶的激活剂为Cl-。