柑橘试管内微芽嫁接方法探讨
第8卷第3期2009年9月
广东轻工职业技术学院学报
JOU RNAL O F GUAN GDON G I NDU STR Y TECHN I CAL COLL EG E
V ol . 8 N o . 3S ep. 2009
柑橘试管内微芽嫁接方法探讨
刘文龙 李进进 陈升云 翟华东 李志龙 李果安黄维清 吴锦强 陈永炽 李海滔 卢 欣
(广东轻工职业技术学院食品与生物工程系, 广东广州510300)
摘 要:目的:通过试管内微芽嫁接获得无病毒柑橘种苗。方法:用酸橙种子经消毒后在
试管内播种作为砧木来源, 采用还没有自剪的优良柑桔品种的嫩梢, 取其一定大小的茎尖作为接穗进行试管内嫁接。结果:在种子消毒过程中, 用75%酒精10s +NaCl O 8m in +HgCl 210m in 的效果明显比其它三种消毒方法污染率低; 在接种过程中, 去除外壳的种子萌芽率最高; 接穗的消毒用NaCl O 10m in +Hg Cl 28m in 的消毒方法污染率较低。关键词:柑橘; 接穗; 微芽嫁接中图分类号:S666 文献标识码:A 1672(2 柑橘病毒病及类病毒病的危害很大, 全世界, 害。, 死40万株; 、广东、浙江、福建、; 。
我国于70年代初对茎尖组织培育进行了初步实验, 为防止柑桔病毒危害提供了有效途径。采用离体培养与嫁接结合的茎尖微芽嫁接技术可排除病毒培育无病毒苗木, 其步骤是:砧木试管内播种———茎尖微芽嫁接———嫁接苗试管培养———移栽或转接———转接苗培育———脱病毒结果鉴定。“微芽嫁接”是现今解决这一难题的一个最有效的途径之一, 本实验对这一技术进行了研究和探讨。
大量元素的配比(10X MS )
无机盐
取量/g
1916. 53. 71. 7
, 要求含有各种有机物和植物激素等成分, 如果每次配培养
基都逐个地称量则很浪费时间, 而且有些成分用量极少, 称量极小的重量既浪费时间, 又不准确。因此, 在配置培养基时, 为了方便和减少误差, 首先把培养基中的各种成分配成一定浓度的溶液, 即培养基母液, 然后根据培养基配方、母液浓度和需要配制培养基的体积来计算所需母液的体积, 用量筒和取样器量取即可。
以下为大量元素、微量元素、有机成分的组成及配比:
1 材料与方法
1. 1 实验材料与试剂
(1) 实验材料:酸橙种子; 柑桔嫩芽。
(2) 实验试剂(消毒剂) :酒精75%; NaCl O 2%(体积比) ; Hg Cl 21mg/L(以下免浓度及单位)
K NO 3NH 4NO 3MgS O 4・7H 2O
KH 2P O 4
以上置入500mL 烧杯中, 充分溶解。而CaCl 2・2H 2O 4. 4g 或无水CaCl 23. 31g 充分溶解后倒入
上述溶液中定容成1000mL 即成10X MS 。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 培养基的制备
(1) 培养基母液的配制
收稿日期:2009-07-01
作者简介:刘文龙(1979—) , 男。
第3期
有机成份配比(100X )
有机盐
肌醇甘氨酸烟酸
VB1VB6
刘文龙等:柑橘试管内微芽嫁接方法探讨 15
取量/mg
5000100
252525
材料, 切取约0. 7mm 的茎尖进行嫁接。
(1) 选取生长健壮的嫩芽用自来水冲洗干净, 放于烧杯中在接种室的超净工作台上, 采用两种消毒方式, 消毒后用无菌水冲洗3-4次:
①酒精10s +NaClO 8m in +HgCl 26m in ②NaCl O 10m in +HgCl 28m in (2) 嫁接:作为对比实验, 采用三种方式嫁接:①直接在培养瓶内, 用弯嘴剪刀在整个苗的三分之一处剪去上部分, 将接穗切取0. 7mm 左右, 然后将接穗放到砧木的伤口处, 实验直接在试管内进行;
②将砧木苗取出培养瓶, 在培养皿上操作, 尽量缩短砧木和接穗在培养瓶外暴露的时间;
③, , 然, , 深0. 5mm 左右的茎尖, 使茎尖与砧木切口紧密结合。
在实验后的几天内, 尽量避免碰撞培养瓶, 因为刚完成嫁接的植株还未完全愈合, 茎尖很容易受到振动而掉落。将嫁接好的培养瓶进行暗培养, 3～5d 后再放置于自然光下培养, 定期观察其成活率。
配成500mL 成100X 有机母液。
微量元素配比(100X )
无机盐
MnS O 4・4H 2O 或MnS O 4・H 2O
ZnS O 4・7H 2O
H 3BO 3
KI
Na MoO 4・2H 2O CuS O 4・5H 2O CoCl 2・6H 2O
取量/mg
2230或1690
[1**********]. 52. 5
(2) 培养基的配制
玻璃器皿充分清洗→干燥
↓
加入3%的
蔗糖→定溶→pH . 8琼脂→分装→→嫁接) 1. 2. 2 选取饱满的酸橙种子用酒精、NaCl O 、HgCl 2进行了不同消毒时间的对比实验。消毒方法有:
(1) 酒精10s +NaClO 10m in +HgCl 28m in (2) 酒精10s +NaCl O 10m in +HgCl 212m in (3) 酒精10s +NaCl O 8m in +HgCl 28m in (4) 酒精10s +NaCl O 8m in +HgCl 210m in 用镊子将消毒好的种子接种到已准备好的培养基中, 注意接种时, 使培养瓶成一定的倾斜度, 使手拿镊子的接种过程不直接在培养基上方进行, 以减少污染机会。为了能让种子有足够的空间生长, 每瓶接种3粒, 尽量避免把种子埋于培养基内。然后将培养瓶放置于培养架上培养, 条件:23℃-25℃, 遮光培养, 直到萌发时再置于光照下。1. 2. 3 种子接种时不同的处理形式
为了提高种子萌芽率, 我们对种子采用了三种接种处理方式:
(1) 不做任何处理; (2) 刨去外部硬核(3) 使用种胚1. 2. 4 微芽嫁接方法
选取还没有自剪的优良观赏柑桔品种嫩芽作为
2 结果与分析
2. 1 种子消毒结果及分析
种子经一系列消毒后进行观察统计, 结果如表1。
表1 种子的消毒对比实验
消毒方法
(代号同1. 2. 2)
(1) (2) (3) (4)
接种瓶数
40404040
污染瓶数
101282
污染率/%
2530205
注:接种时间为6月17日, 接种后15d 统计。
根据种子消毒的对比实验表1的数据初步得出
以下结论:用75%酒精10s +NaCl O 8m in +HgCl 210m in 的效果明显比其它三种消毒方法污染率低,
这可能与消毒剂的最佳搭配浓度及消毒时间有关。
16广东轻工职业技术学院学报第8卷
2. 2 种子的不同处理方式的发芽结果及分析
种子经不同方式的处理后进行接种, 约20d 进行观察统计, 结果如表2。
表2 种子的不同处理方式接种实验
种子接种处理不做任何处理刨去外部硬核使用种胚
接种瓶数
404040
异性, 将接穗顶开而影响接穗与砧木愈合。这次实验虽然取得了阶段性的成绩。但因为时
间和实验条件的限制, 实验结果还不够完善, 还不能进行脱病毒结果的鉴定。
成活数
32380
萌芽率/%
80950
3 小结
柑橘无病毒苗木生产可以克服目前柑橘上发生较重、难以用化学试剂预防或防治的黄龙病、裂皮病、衰退病等病毒性病害, 实现柑橘苗木的无毒化栽培。茎尖嫁接技术的应用主要是依据Morel 等的研究:病原体在植物体内分布的不均匀性, 顶端分生组织几乎没有或检测不出病原体, 嫁接后存活的植株与母本是完全一致的。这在培育无病良种苗木上具有重要的意义:, , 而且茎尖。自这种方, 。
毒很难脱除, 另外茎尖的取材受到季节的限制, 各个梢期的新梢萌发时间很短, 并且柑橘类有一个自身的生理特征即新梢自剪, 这就使应用茎尖材料的时间非常有限, 如何保持茎尖的可持续利用是一个值得探讨得问题。随着生物技术的迅速发展, 茎尖嫁接技术将会与柑橘常规育种、体细胞杂交以及抗病基因转化等技术结合起来, 在柑橘生产中发挥越来越大的作用。
注:本实验研究为学生挑战杯课题, 作者除李进进为指导老师外, 其他均为园林071和园林081学生。参考文献:
[1] 王振龙. 植物组织培养[M].2007.
[2] 杨世杰, 卢善发. 植物嫁接基础理论研究下[J ]. 生
针对种子的不同处理方式, 从表2可以看出:其
中去除外壳的种子萌芽率最高, 用胚培养的萌芽率最低, 也许是去掉外壳的种子的休眠期被解除, 所以很容易发芽。
2. 3 接穗消毒结果及分析
接穗用以下二种消毒方法:①酒精10s +NaClO 8m in +HgCl 26m in 、②NaCl O 10m in +HgCl 28m in 均用无菌水冲洗3～4次, 约15d 后统计污染情况。结果如表3。
表3 消毒方法
(1) (2)
7
9035
针对接穗的消毒对比实验, 从表3可以得出:用
NaCl O 10m in +HgCl 28m in +无菌水冲洗3～4次的消毒方法污染率较低, 这可能也与消毒剂的最佳搭配浓度及消毒时间有关。
2. 4 不同方式的嫁接对成活率的影响
接穗经不同方式嫁接后约15d 进行观察统计, 结果如表4。
表4 不同方式的嫁接对比实验
嫁接方式
培养瓶内嫁接, 将接穗直接置于砧木上培养瓶外嫁接, 将接穗夹于砧木切口内培养瓶外嫁接, 接穗置于砧木切口上
接种瓶数成活数成活率/%
202010
4100
20500
物学通报, 1995(30) (10) :4～6.
[3] 赵学源, 蒋元晖, 李世菱等. 我国柑橘栽培品种的裂皮
病的鉴定与脱除[J ].园艺学报, 1986, 13(2) :91～
针对不同方式的嫁接对成活率的影响结果, 从
表4的数据作出以下分析:在培养瓶内嫁接的成活率不高, 或许是因为接穗不易和砧木愈合而导致接穗脱落或干枯, 或者是砧木迅速萌发的侧芽具有排
94.
[4] 蒋林, 丁平, 郑迎冬. 添加剂对铁皮石斛组织培养和快
速繁殖的影响[J ].中药材, 2003, (08) :5～10.
(下转第20页)
责任编辑:张赣霞
20广东轻工职业技术学院学报第8卷
Experi m ent al Study on Three 2di m ensi onal Electrode /FentonReagent/Neutralizati on M ethod for O il Pa i n tWastewater Treat ment
He J inqiang
(The Depart m ent of Food and B i o 2technol ogy Engineer, Guangdong I ndustry Technical College, Guangzhou 510300, China )
Abstract:The three 2di m ensi onal electr ode /fent on reagent/neutralizati on method was used t o treat high concentra 2ti on oil paint waste water in a package p lant in Guangdong Pr ovince . The result shows re moval of COD f or oil paint waste water reached 67. 1%when the ir on p late is used as electr odes with an app lied potential of 18V , an electr ode s pan of 4c m , pH nature and an electr olytic ti m e of 3h ; then using fent on reagent p r ocess t o treat the electr olytic
2+
waste water , the effluent COD is 109mg/Lwhen H 2O 2dosage is 13mL /L(30%) , Fe dosage is 40mL /L
(10%) and the reacti on ti m e is 3h ; then pH of treating water is adjusted t o 6～9, the effluent COD can be de 2creased t o bel ow 100mg/L.The effluent quality can meet the second class criteria of I W aste water D is 2charge Standard (G B8978-1996) .
Key words:three 2di m ensi onal electr ode; fent on reagent; on water; water treat 2ment .
(上接第16D iscussi on on Orange M i cro 2shoots Grafti n g i n Tube
L iu W enlong, L i J in jin, Chen Shengyun, Zha i Huadong, L i Zhilong, L i Guoan
Huang W eiqing, W u J ingqiang, Chen Yongchi, L i Haitao, L u X in
(The Depart m ent of Food and B i o 2technol ogy Engineering, Guangdong I ndustry Technical College, Guangzhou 510300, China )
Abstract:I m p r oved orange tree seeds without viruses were gained by m icr o 2shoots grafting . The s our organge seeds which were sterilized were selected as st ock sci on s ource . Some fixed size of tender t op s of good orange ste m s with 2out self cuting were grafted in the tube . During the seeds sterilizing, the conta m inate rate by using 75%alcohol 10s +NaClO 8m in +Hg Cl 210m in was l ower than other three sterilzing ways . W hile inoculati ons the conta m inate rate by using NaCl O 10m in +HgCl 28m in was l ower . Key words:orange; sci on; m icr o 2shoots grafting