番茄黄萎病病原菌研究

番茄黄萎病病原菌研究

摘要：近年来在黑龙江省的保护地番茄上发现一种番茄病害，并从其病茎上分离得到了10个菌株。接种番茄幼苗上，发病症状与自然发病症状完全一致，并从接种病株上重新分离到此病原菌。经鉴定此病原菌为大丽轮枝菌（Vertillium dahliae Kleb）。对其生物学特性研究证明：菌丝生长最低温度为5℃，最适范围20—25℃，以22.5℃生长最适；孢子在5—30℃都可萌发。萌发的最适温度为25℃；菌丝在PH4—8都能生长，以PH5生长最好。

关键词：番茄黄萎病，生物学特性，致病性

番茄黄萎病是保护地和露地番茄生产的重要病害之一。可大幅度降低番茄的产量和品质，是番茄生产的一个主要限制因素。希腊番茄黄萎病严重，有时会使番茄产量下降50%甚至更多（Thanassoulopoulos CC，1972）。南非、加拿大、意大利、法国、美国等都有报道，产量损失23%以上。国外开展的番茄抗黄萎病育种起步早，成果显著。对该病有大量的研究报道，涉及病原形态、发生规律、检验技术年、品种抗病性、抗病机制、病害防治和病原与寄主互作的分子生物学等，现已经克隆得到了番茄的抗病基因Ve ，并导入了现有品种当中。

番茄黄萎病多发生于番茄生长后期，叶片由下向上逐渐变黄，首先是叶缘变色，变色沿叶脉扩大，轮廓清晰，成为“V ”形黄斑，以后下部叶片明显枯死。发病重的结果小或不能结果，剖开病株茎部，维管束变浅褐色，病株并不迅速枯死，而是逐渐落叶，表现慢性的向上枯死，别于枯萎病。对植株两侧叶片同时表现症状，还是出现半边风现象报道不一，北迟健治（1980）、五十岚文雄（1979）报道有半边风现象出现；远藤忠光（1980）的报道则没有此现象的描述。

此病害在我国很少发生，但也有报道，陕西关中地区曾发现此种病害，黑龙江省也有报道。近年来在保护地番茄生产中此病害有加重蔓延的趋势。本文报告对病原菌的鉴定及病原生物学特性的研究结果。

1、 材料与方法

1.1菌种的分离与鉴定

1.1.1分离 用灭菌解剖刀切取病健交界部位的茎段，升汞浸泡1-2分钟, 无菌水冲洗在无菌操作下分离培养、纯化并做单孢分离。

1.1.2致病性测定 将消毒后的东农704番茄种子播种在灭过菌的沙土中,1—2片真叶展平时，将幼苗拔出，断根处理。1×10/ml孢子悬浮液浸根20分钟，移至营养钵中。调查记载发病情况，并从发病植株再次分离病原菌。

1.1.3菌种的鉴定 将供试的单孢菌株分别接种PDA ，25℃下恒温培养10天。观察有无微菌核的出现，孢子梗基部的颜色、菌落的特征。

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1.2生物学特性的研究

1.2.1病原菌的形态特点 将供试菌株分别接种PDA ，25℃下恒温培养10天。观察菌落质地、形状、颜色，分生孢子大小，孢梗长度，轮枝间距，孢梗轮回数，每轮梗数。 1.2.2不同培养基对菌丝生长的影响：

供试的菌株的菌落边缘取直径1mm 菌丝块，分别接种在PSA 、低量蔗糖酵母浸膏琼脂培养基、玉米培养基、蔡氏培养基、马铃薯胡萝卜琼脂培养基、寄主汁培养基（200克番茄茎加20克琼脂配成1000ml ）的平板中央，放于25℃的恒温箱内培养，三次重复，15天后测量菌落直径。培养基配方见《真菌病理学和真菌学技术汇编》。 1.2.3不同培养基对产孢的影响：

配制一定浓度的病菌孢子悬浮液，各加一滴（用无菌注射器）于配制好的以上几种培养基的平板中央，放于25℃的恒温箱内培养，三次重复，15天后取出，分别用无菌水洗下每一菌落的孢子，各处理配成等体积的孢子悬浮液，血球计数板法测定各处理的孢子浓度。

1.2.4温度对菌丝生长的影响

从培养10天的菌株的平板上切取生长均匀，直径05cm 的菌丝圆片，置PDA 平板中，分别于5℃、10℃、15℃、20℃、22.5℃、25℃、30℃、33℃下培养10天，测定菌落直径，每处理重复3次，找出菌丝生长最适温度。 1.2.5温度对孢子萌发的影响

配置洋菜培养基，将用无菌水稀释到一定浓度的孢子悬浮液用无菌注射器加一滴于平板中央，分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、22.5℃、25℃、30℃、33℃下培养，每6小时观察一次孢子萌发率，共观察4次，3次重复。找出孢子萌发最适温度

1.2.6酸度对病原菌的影响 用1N HCL 或NaOH 调节PDA 成PH3—8的6个梯度，将供试菌株分别接种PDA ，23℃下恒温培养7天，测定菌落直径，每处理重复3次。 1.2.7紫外线对菌丝生长的影响 将培养7天的菌株圆片接种于PDA 平板，置高度55厘米的45W 紫外灯下，分别照射5、10、20、30、40、50分钟后，置23℃培养7天，测量菌落生长直径，每处理重复3次。

1.3寄主范围测定 将供试菌株接种到番茄、辣椒、黄瓜、茄子、甜瓜上，采用浸

根接种法，接种的孢子浓度为10个/ml，15天后调查发病率。

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2、实验结果

2.1菌种的鉴定

2.1.1被分离的菌株均有较强的致病力。潜育期10—15天。发病株率100%。 2.1.2分离纯化的菌株在30℃能生长并能产生微菌核，孢子梗基部无色透明。

2.2生物学特性的研究

2.2.1形态特点 菌丝体无色，有隔膜，所有菌株均可产生轮枝分生孢子梗，孢子梗直立，基部无色，孢子子梗上有1—5个轮枝层，每层有2—3枝轮枝。分生孢子椭圆形，单孢，无色透明，单生于分枝末端，湿度大时成假头状，在培养基上形成黑色微菌核，但未发现串生厚垣孢子。轮枝间距49.5—98.2微米，微菌核40.2—75.0×26.3—58.2

微米，分生孢子15.0—35.0×5.1—7.5微米，分生孢子梗长10.0—35.1微米。

菌落形态可分为三种类型：（1）A 型：产生气生菌丝和大量微菌核，菌落中间为白色气生菌丝团，基质内布满黑色微菌核；（2）B 型：气生菌丝发达，呈绒毛状或棉絮状，培养两周未见产生微菌核；（3）C 型：菌丝体匍匐生长，无色，不产生或极少产生气生菌丝，不产生孢 子和微菌核。三种菌落形态不稳定，可以相互转化。 2.2.2不同培养基对菌丝生长的影响

图1不同培养基上菌丝生长比较

Fig 3-1 comparison of hypha growth in different culture mediums

5

菌落直径（c m ）

43210

1

2

3

4培 养 基

5

6

1玉米粉培养基 2 PSA 3番茄汁培养基 4低量蔗糖酵母浸膏琼脂培养基 5蔡氏培养基 6马铃薯胡萝卜琼脂培养基

表1不同培养基上菌丝生长差异显著性比较（SSR 法）

Table 1 significant test of hypha growth in different culture mediums( SSR )

（单位：cm ）

从图1及表1可以看出，供试菌株在各培养基上均可以生长，在PSA 蔡氏培养基和寄主汁培养基上生长最好。在PSA 培养基上的生长状况极显著的好于在其他培养基上的

生长，菌丝旺盛、长势强。

2.2.3不同培养基对病菌产孢量的影响

表2不同培养基上病菌产孢量差异显著性比较（SSR 法）

Table 3-5 significant test of spore yield of V erticillium . dahliae in different culture mediums(SSR )

图2不同培养基产孢比较图

Fig 2 comparison of spore yield in different culture mediums

1番茄汁培养基 2蔡氏培养基 3 PSA 4低量蔗糖酵母浸膏琼脂培养基 5马铃薯胡萝卜琼脂培养

基 6玉米粉培养基

番茄黄萎病菌不易产孢，在寄主汁和玉米粉培养基上产孢量稍高于在PSA 上的产孢

量，但也相对较少，在马铃薯胡萝卜琼脂培养基上产孢最多，即显著高于在其他培养基上的产孢量，在蔡氏培养基上产孢次之，好于寄主汁和玉米粉培养基。 2.2.4温度对菌丝生长的影响

图3 温度对菌丝生长的影响

Fig 3 effect of different temperatures on hypha growth

4.543.5

菌落直径（c m ）

32.521.510.505℃

10℃

15℃

20℃

22.5℃

25℃

30℃

33℃

温度

表3不同温度下黄萎病菌菌丝生长差异显著性比较

Table 3-7 significant test of hypha growth V erticillium . dahliae under different temperatures

图3及表3表明菌丝在5℃—30℃均能生长，最低生长温度5℃，最适范围20—25℃，以22.5℃生长最适。5℃时番茄黄萎病菌丝生长缓慢，在培养10天后菌落直径没有改变；30℃时长势弱于在5℃时的长势，培养基表面微现白色菌丝体，镜检可观察到菌丝体生长，培养10天菌落直径未改变；33℃条件下接种的菌片表面无改变。 2.2.5温度对孢子萌发的影响

番茄黄萎病菌的孢子在5-30℃都可萌发。萌发的最适温度为25℃，萌发温度的适宜程度依次为25℃＞22.5℃＞20℃＞30℃。在10℃以下孢子萌发缓慢，24小时才开始萌发，42小时萌发率最高；在22.5℃以上时，24小时萌发率42%，48小时萌发旺盛。 以42小时孢子萌发情况为例进行分析（见图4及表4），25℃下孢子萌发率最高，显著高于其他温度下孢子的萌发率。5℃孢子萌发极少，几视野中才能见到一个，10℃-15℃萌发量略有上升，20℃—30℃为适宜萌发范围。

图4不同温度下番茄黄萎病菌孢子萌发比较

Fig 4 comparison of spore germination of V erticillium . dahliae under different temperatures

2.2.6 PH值对生长的影响 番茄黄萎病菌菌丝在PH4—8都能生长，在不同的PH 值下从菌株的平均菌落生长直径看，以PH5生长最好, 说明番茄黄萎病菌适宜生长在弱酸性环境 （见表5、表6）。

表8不同PH 值培养基对黄萎病菌菌丝生长方差分析表 T able 3-10 variance analysis of effect of different PH culture mediums on hypha growth of V erticillium . dahliae

表9不同PH 值培养基对黄萎病菌菌丝生长差异显著

T able 3-11 significant test of effect of different PH culture mediums on hypha growth of V erticillium . dahliae

2.3致病范围 番茄黄萎菌同时侵染茄子、辣椒、黄瓜、甜瓜、西瓜等蔬菜作物。

3、讨论

3.1试验证明，分离所得菌株为大丽轮枝菌（V.dahliae ）。

3.2从生物学特性及致病性上分析，可初步认为所得的几个菌株可能为同一生理小种，但需进一步证明。

Study on Tomato Vertillium dahliae

Abstract: in recent years,a new disease was found in protective tomato yield in heilongjiang And we isolated 10 strains from root-stem in disease plant.after inoculating on tomato seeding,the symptom is completely consistant with that in natural condition, and this pathogen was isolated from disease seeding once again.we identified that this pathogen belongs to verticillium . dahiea .kleb .study on biological characteristics indicated: The lowest temperature of hypha growth is 5℃,the suitable temperature range is

20-25℃,the optimal temperature is 22.5℃,spore may germinate from 5℃ to 30℃.the optimal temperature is 25℃;hypha may grow in PH4 –8 and the best in PH 5.

Key Words: verticillium . dahiea ,biological characteristic, pathogenicity