酵母展示筛选scFv方法的建立_尹成凯
1204 论著
ISSN 1007-8738细胞与分子免疫学杂志(Ch i n J C ellM o l I mmuno l) 2009, 25(12)
文章编号:1007-8738(2009) 12-1204-03
酵母展示筛选sc Fv 方法的建立
尹成凯, 徐黎明, 任桂萍, 张 巧, 刘向宇, 田 辉, 李德山*
(东北农业大学生命科学学院生物制药实验室, 黑龙江哈尔滨150030) [摘要] 目的:利用酵母展示技术建立筛选scF vs 的技术平台, 为今后从抗体库中筛选高亲和力抗体奠定基础。方法:改造pYD1载体, 将其自身所带的G S L i nker 上下游两端突变出酶切位点, 构建成p Y D -x ; 分别将IL -1 抗体的重链与轻链可变区片段插入p YD-x 中G S L i nker 的上下游, 构建出重组质粒pYSD 1。从p Y S D 1上PCR 扩增出scFv 片段, 并将其插入pYD1的M CS 区, 构建出重组质粒p Y S D 2。将pYSD 1与pYSD 2分别转入酿酒酵母EBY 100中诱导表达scF v , 并用流式细胞术(FC M ) 检测抗体展示情况。结果:经诱导后, 从流式细胞仪检测结果中可以看出EBY 100-p Y SD1所展示的scF v 与抗原结合力很弱, 而EB Y 100-p Y S D 2则表现出一定强度的结合。结论:本实验证明了p Y D -x 载体上存在的额外的G S L i nker 对于抗体展示的必要性, 并且成功建立了利用酵母展示载体p YD1进行scF vs 筛选的技术平台。[关键词]酵母展示; p Y D1; scFv ; G S li nker [中图分类号]R392. 11 [文献标识码]B
确的折叠和修饰。而酵母菌为真核生物, 弥补了噬菌体展示技术的此项不足, 能使复杂真核蛋白得到展示, 同时又保留了噬菌体表面展示技术的便于筛选、扩增等优点, 继承了噬菌体展示的表现型与基因型一致和易于扩增的特性, 可根据编码蛋白的特性对目的基因进行筛选
[4]
。
目前国内还没有关于利用酵母展示进行筛选抗体的报道, 此次实验利用了酵母展示细胞EB Y l 00展示重组抗人I L -1 sc Fv 片段, 经流式细胞术(FC M ) 可检测出一定强度的荧光信号, 证明用于筛选sc Fv 的平台已构建成功。此外, 该系统同时可以用于scFv 抗体的亲和力成熟, 以提高抗体的亲和力, 为今后筛选高亲和力抗体奠定了基础。1 材料和方法
酿酒酵母是具有细胞壁的单细胞真核微生物, 有两种交配型MATa 和MAT 的单倍体细胞, 这两种细胞之间的相互交配融合是通过细胞表面表达a -凝集素和 -凝集素的相互作用介导的
[1]
1. 1 材料 p YD 1(Cat . N o . V 835-01) 购自Inv itrogen 公司,
EBY 100(Cat . N o . V 835-01) 购自Inv itrogen 公司, pEA I(含有抗人IL-1 抗体基因) 由本实验保存, rhI L-1 (本实验表达), F I T C ant-i hu m an I L-1 anti body (Cat . N o . 11-7018) 购自eB io -sc i ence 公司, DNA M arker 购自T aK aR a 公司。1. 2 方法
1. 2. 1 目的基因的获得及重组载体的构建 以p EA I 为模板, PC R 扩增出重链可变区(VH ) 与轻链可变区(V L ), 并在V H 两端分别加入H i n d /N he , V L 两端分别加入Ba m H /X ho , 所用引物序列为p VH :5- CCCAAGCTTCAGGTGCAGCTGGTG -CAGTCTG-3 ; pVH :5 -CTAGCTAGCGGAGGAGACGGTGAC -CAGGGTG-3 ; p VL :5 -CG CGGATCCGATATTCA GATGA CT -CAGTCTCCAT-3 ;
pVL :
5 -CCGCTCGAGTTAAGTTCGTTT -GATCT CCACCT-3 。以pYD1为模板ho t -start PCR 扩增出G S L i nker , 并将其上游末端突变出N he , 下游末端突变出Ba m H , 而并不改变其氨基酸序列, 目的是为了今后能够将抗体序列插入载体中, 所用引物序列为p G :5 -CCCAAG CT -TCTGCAGG CTG CTAGCGGTGGTGG-3 ;
p G :
5 -GTCCAC -CAGTCATGGATCCA CCACCA CC -3 。将p YD 1载体用H in d /Ba m H 酶切, 去除原有GS L i nker 与X press ep itope , 将PCR 扩增所得的G S L i nke r 连接至载体中, 得到载体p YD-x 。用H in d /N he 切割后插入V H , 用Ba m H /X ho 切割后插入V L , 得到展示用载体pYSD 1; 以p Y SD1为模板, 引物为p VH :5 -ATAAGAATGCGGCCGCCAGGTG CAG CTGGTG-3 与p VL , 的。a -凝集素
[2]
和 -凝集素是酵母细胞壁上的两种甘露糖蛋白,
它们在酿酒酵母的这两种单倍体细胞之间介导细胞与细胞的性黏附, 使细胞融合形成双倍体。本实验所用系统为a -凝集素表面展示系统, a -凝集素包括两种亚基Aga1p(725个氨基酸残基) 与Aga2p(69个氨基酸残基), Aga1p 亚单位通过 葡聚糖的共价连接而锚定在细胞壁上, Aga2p 亚单位通过两对二硫键与Aga1p 亚单位相连接, 此系统将目的蛋白的N 端与Aga2p 的C 端部分融合, 目的蛋白经a 凝集素展示于酵母细胞表面
[3]
。以往应用广泛的噬菌体展示与细
菌展示均为原核展示, 不能对所表达的蛋白进行正
收稿日期:2009-02-09; 接受日期:2009-03-30
基金项目:哈尔滨市科技创新人才发展计划资助(2006RFXXS002);
东北农业大学创新团队发展计划资助; 黑龙江省教育厅项目(11521022); 哈尔滨市科技创新人才研究专项资金(2008RF QXS017)
作者简介:尹成凯(1983-), 男, 黑龙江哈尔滨人, 硕士生
Te:l 0451-55190645; E-m ai:l yck_83@163. co m
*Corres pond i ng author
ISSN 1007-8738细胞与分子免疫学杂志(Ch i n J C ellM o l I mmuno l) 2009, 25(12) pYD1中, 构建成p Y SD2。
1. 2. 2 p Y SD1与p Y S D 2的转化与诱导表达 接酵母EB Y 100单菌落于YPD (1%yeast ex tract , 2%peptone , 2%D-g l ucose) 中30 过夜培养, 2次接种活化后1%接种于500mL Y PD 中30 过夜培养至A 600 1. 3-1. 5, 4
4000g 离心收获细胞,
用80mL 无菌水重悬。在悬液中加入10mL 10 TE Buffer (10mm o l/LT r is -C , l 1mmo l/LEDTA, p H 7. 5) 混匀, 再加入10mL 10 L i A c 贮存液并摇匀, 于30 轻轻摇动45m i n , 加入2. 5mL 1m o l/LDTT, 同时于30 轻轻摇动15m i n 。将菌悬液用250mL 冷水、30mL 冰冷的1m o l/L山梨醇溶液各洗涤1次。0. 5mL 冰冷的1m ol/L山梨醇溶液重悬菌体(每50 L 菌体转化DNA 量≦100ng ) [5]。3个Eppendorf 管中均含有50 L 菌体, 并分别加入100ng pYSD 1、100ng p Y SD2、去离子水(阴性对照) 。1. 5kV 电击转化, 加入450 L 山梨醇溶液重悬菌体, 取10 L 菌体加入990 L 山梨醇溶液, 取10 L 溶液涂布平板, 所用固体培养基为M i n i m a l D extrose (0. 67%YN B , 2%g l ucose , 0. 01%L eu , 1. 5%A ga r) , 30 培养72h 。计算转化率, 计算方法为50 100 103 菌落数/100。
将EBY 100-pYSD 1与EB Y 100-p Y S D 2的单菌落分别接入含葡萄糖YN B -CAA (0. 67%YN B , 0. 5%酪蛋白水解物, 2%g l ucose o r ga l actose) 中30 过夜培养至A 600 3-4, 4000g 离心5~10m i n 收获细胞, 用含半乳糖YNB -C AA 调整细胞浓度至A 600 0. 5-1, 30 震荡培养, 分别于0h 、48h 取样。1. 2. 3
EBY 100-p Y SD1与EBY 100-pYSD 2的展示检测 将
EBY 100-p Y SD1与EBY 100-pYSD 2菌体用PBS(p H 7. 4) 洗涤1次, 180 L PBS 重悬。加入20 L 1mL /LBS A 贮存液、2 g 人IL -1 , 4 孵育1h , PBS 洗涤1次, 180 L PBS 重悬。加入20 L 1mL /LBS A 贮存液、1 L F I TC ant-i hu m an IL -1 an -ti body(0. 5g /L), 4 避光孵育1h , PBS 洗涤1次, 1mL PBS 重悬。用流式细胞仪于488n m 激光下检测其荧光强度[6]。所用流式细胞仪型号为BD FA CSA r i a 后检测。
Tm
1205
图1 V H , V L 片段扩增结果
1:V L frag m en t ; 2:V H f rag m en t ; M :100bp marker .
图2 p Y SD1与p Y S D 2的PCR 鉴定
1:PCR identification of pYSD1; 2:100bp DNA m arker ; 3:PCR i den tif-i cati on of pYSD2; 4: -E coT14d i gestDNA m arker .
图3 利用FC M 检测EBY 100-p Y SD1与EBY100-p Y SD2所展示scFv 与IL-1 的结合效果
a :EBY100(untransfor m ed )
treated w it h I L -1 and an ti body -FITC;
c :EBY100-b:EBY100-pYSD1treated w ith I L-1 and anti body -FITC; pYSD2treated w ith I L-1 and anti body -FI TC.
Ce ll So rter 334078, 阴
性对照设置为工程菌(经转化) 不经抗原处理, 仅用抗体孵育
2 结果
2. 1 重组质粒的构建和鉴定 以p EA I 为模板扩增出的V H 和V L 片段, 琼脂糖电泳结果见图1。经测序鉴定, 重组载体pYD-x 序列正确。将V H 与V L 片段插入p YD-x 中构建成pYSD 1并将scF v 插入p Y SD1构建出p Y S D 2, 两种载体均用pVH 与p V L 引物进行PCR 扩增鉴定, 扩增出的scF v 条带大小与预计结果相符, 约750bp , 证明成功构建出p Y SD1与pYSD 2, 具体结果见图2。酵母转化后, 平板上菌落平均为300个, 根据计算方法得出转化效率约为1. 5 107。2. 2 EBY100-pYSD1与EBY100-pYSD2的FC M 检测 与阴性对照相比, EB Y 100-p Y S D 1的峰值只有很小的偏移, 说明其展示的scF v 与抗原结合能力很弱; 而EBY100-p Y S D 2的峰值偏移较大, 证明了其所展示scF v 能够与抗原很好的结合。
具体结果见图3。
3 讨论
现今使用广泛的噬菌体展示技术虽然库容量大, 但其不能通过FC M 进行高通量筛选, 费时费力, 且由于是原核表达系统, 不能对哺乳动物蛋白进行有效地、正确地折叠与修饰。酵母菌为真核生物, 其蛋白修饰系统与哺乳动物极其相似, 因此能使复杂真核蛋白得到展示, 而且酵母细胞的颗粒较大, 可通过FC M 进行高通量筛选, 大大减少了筛选的工作量,
提高了效率。此外酵母还具备另一个优点, 就是它的安全性, 一些酵母菌已在食品生产中得到广泛应用, 可以更容易过渡到药品和疫苗生产。该系统可
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质抗原表位分析等许多方面。
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目前国内尚无利用酵母展示系统筛选抗体的报
道, 此次实验以pYD1为基础构建了两种酵母展示载体, 并利用FC M 对其可行性进行了检测, 得到以下成果:证明了pYD-x 载体上存在的额外的GS L i n ker 对于抗体展示的必要性, 初步分析可能是由于Aga2对随其所展示的抗体在折叠或是与抗原反应方面有一定的影响, 载体自带的GS L i n ker 是一种柔性的连接肽, 能够起到在空间上分离Aga2与sc Fv 的作用, 使A ga2对sc Fv 的正确折叠并与抗原正确结合; 建立了酵母展示抗体库的技术平台, 由于将GS L i n ker 改造为带有酶切位点的序列, 抗体基因扩增后可直接连接至GS L i n ker 的上下游, 较重叠PCR 更快捷且更有效率; 酵母展示适合于展示小型突变抗体库(~1 10)
6
[7]
, 此次实验得到了1. 5 10的转化效
7
率, 足以达到利用酵母展示系统筛选的要求, 这些工
作均为今后抗体库的建立与筛选奠定了基础。
(上接1203页)
(ZO-1, ZO-2和Z O-3) 等外周胞浆蛋白组成。近年已证实C laud i n 蛋白是构成紧密连接的骨架蛋白, 其异常表达可导致上皮细胞、内皮细胞结构破坏、功能受损, 可能在多种疾病的发病过程中起重要作用。到目前为止, 已发现C laudin 基因家族包括24个成员
[4]
[3]
均可以在不同水平表达C laudin 18. 2, 而胰岛细胞癌细胞系则不能表达C laudin 18. 2, 该结果与前期胰腺癌和胃癌患者的免疫组化检测结果一致。所以,
通过该研究我们进一步在体外细胞水平上证实C lau -din 18. 2的表达, 为研究C laudi n 18的分子作用机制提供了较好的细胞模型, 从而为临床诊断胰腺癌及其早期原位癌提供了良好的标志物, 同时, 有可能为临床胰腺导管腺癌的治疗提供新的靶位。参考文献:
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, 其序列的一致性为12. 5%~69. 7%, 该结果
表明它们在进化上呈功能高度保守性。C laudi n 的M r
为22000~27000。每一个C laud i n 分子均具有相同的结构, 其肽链包含有4个跨膜区、2个细胞外环形结构和位于胞质中的羧基端、氨基端。第1和第4个跨膜区以及第2个细胞外环的氨基酸序列具有高
[5]
度保守性。第4个跨膜区对闭锁蛋白准确定位于紧密连接起重要的作用, 若丢失将会导致闭锁蛋白的羧基末端错位到细胞外间隙。两个细胞外环参与同种或异种C laud i n 蛋白之间的结合, 对紧密连接条带形成和离子通透选择性具有重要作用。人源性C laud i n 18基因具有2个不同的第一个外显子, 所以可以产生两种亚型C laud i n 18. 1和C laudi n 18. 2。这两个分子的N 端69个氨基酸的结构不同, 其位于第
[6]
一个胞外区的环状结构内。C laudi n 18的两种亚型分别在不同的组织中进行转录扩增, 其中, C lau -di n 18. 1主要表达在肺组织, 而C laud i n 18. 2则特异性表达于胃组织。
,