右旋糖酐的分子量

凝胶渗透色谱法

测右旋糖酐的分子量及分子量分布

龙智达公司

于志勇

2013年4月10日

一、右旋糖酐的分子量为什么有分布？

右旋糖酐是一种以[-O-CH2-C6OH3H3-O-]n为单提聚合而成的水溶性大分子多糖聚合物。由于聚合时，每一个分子链的n值不同，使右旋糖酐的分子量有一定的分布。这种分布一般符合正态分布，故右旋糖酐的分子量与我们常见的有机化合物不同，不能用一个数字来表示其分子量。

右旋糖酐的分子量组成是由N1个分子量为M1的分子、N2个分子量为M2的分子、N3

个分子量为M3的分子···Ni个分子量为Mi的分子组成。因此，我们定义右旋糖酐一类的大分子的分子量如下：

数均分子量：

重均分子量：

Z均分子量：

粘均分子量：

NiMiWiMn

WiNi

2

NiMMw

NiMiWiNiMWiMMz

NiMWiMi

3i2

MiWiMi

2i

NiMM

NiMi

1

1i



由于不同的统计方法计算出来的分子量的数值是不同的。一般情况下，多分散样品的平均分子量有这样的次序：Mz >Mw>M>Mn。

表达分子量分布的指标是分子量分布系数D＝Mw/Mn。

二、右旋糖酐的分子量测定

2.1仪器

在做分子量分布测试时，现在最好的方法是凝胶渗透色谱法。最简单的仪器是由一个单元高压泵、手动进样阀、示差检测器和数据工作站组成。

2.1.1泵

一般我们选用高效液相色谱的单元泵（二元、三元泵也可以），对泵来说，泵的重复性不得大于0.5%。由于右旋糖酐的分子量与样品的保留时间有关，每一个级份的保留时间与分子量有一一对应的关系。一般来说，时间相差1％，分子量相差5％左右。对于右旋糖酐40的样品，M10的分子量指标是120,000，5％的误差就是6,000。

2.1.2进样器

进样器要求有进样信号。自动进样器都有进样信号触发线，而手动进样器，最好选用带有进样信号触发线的产品，如7725i。

没有进样信号触发线，每次进样后，由操作人员人工通知电脑开始计时，人员每次操作的时间间隔不同，无法保证样品的重复性。

2.1.3示差检测器

应选用带电子控温的示差检测器，因为示差检测器对温度具有很高的敏感性，温度的微小漂移，都会对基线有影响。最好选用固定温度的示差检测器。目前比较好的示差检测器如：SHODEX RI-71，WATERS…示差检测器。

2.1.4柱温箱

对柱温箱的要求不高，一般控温精度在0.5℃既可。

2.1.5工作站

目前只有北京龙智达公司与中国药品生物制品鉴定所合作开发的GPCW药典版凝胶色谱工作站软件可以直接计算出药典规定的右旋糖酐的分子量各项指标。

2.2凝胶渗透色谱仪是怎样分离右旋糖酐的？

右旋糖酐样品由流动相带入凝胶柱。凝胶柱内的填料是带有不同孔径的小球（粒子直径5－10）组成。样品中的大分子走填料外的路径，而小分子走填料中的孔径，路径相对较大分子长。因此，大分子先流出色谱柱，小分子后流出色谱柱。样品就按分子尺寸的大小分离出来。

2.3如何计算右旋糖酐的分子量？

凝胶渗透色谱法计算分子量是一种相对的方法。因此我们应该先做出仪器的校正曲线，再计算样品的分子量。

2.3.1校正曲线的标定

校正曲线是由几个已知峰位分子量的标准品来标定的。在凝胶渗透色谱中，标准品的分子量是已知的，在色谱图中找出峰位的保留时间，横坐标是峰位值，纵坐标是log(Mp)，这样我们就得到一条直线。2000版药典规定校正曲线选用线形方程，在其它科研中可以选用二次方程或三次方程。

Log(M)=a*t+b

以后，样品上的每一点都代入上式。可以计算出样品的分子量。只要仪器的管路没有变换过，在一个月内可以不标定校正曲线。为保险起见，每周进一个标样，检查该点的峰位保留时间与校正曲线中的时间是否一致。如果不一致，校正曲线应该重新标定。例：

峰位保留时间 标样分子量

15.148 84400 16.336 41100 17.388 21400 18.565 10000

Log(M)= 9.034012*t -0.2708998 R= 0.9998936 (r值一般应>0.999)

2.3.2样品分子量的计算

下图是一个样品的凝胶色谱谱图，首先选取水平基线，扣除水平基线以下的空白部分，

在基线内的每一点的时间代入校正曲线，求出每一点的分子量，在按数均分子量、重均分子量的公式计算出样品的数均分子量和重均分子量及分布。

选取基线时应注意，基线的前端影响大分子，后端影响小分子。这对我们的计算结果有很大的作用。

三、实验技术

3.1制样技术

必须用流动相配制成10mg/ml的溶液，加热充分溶解后，用0.45的超滤膜过滤。否则，溶液中的杂质会堵塞柱子。减小柱子的寿命。

3.2进样

取配好的溶液20ml，进样。计算机接收数据。

3.3柱子的维护

你收到柱子的第一件事是测试柱子的理论塔板数。如塔板数不够8000/根，请立即与供货商联系，维护你的利益。

实验过程中我们应当经常注意系统的压力，系统的压力升高，说明有杂质进入系统或柱子。一般杂质进入柱子的可能性比较大，我们应将柱子反接，用实验的流速反相冲洗柱子，使系统压力下降。如压力不降，应检查系统的其它部件。流动相中加入迭氮化钠是起防腐作用。

柱子的安装：将泵的流速设为0.2ml/min，看到管子有流动相滴出时，把柱子进口的堵头拆下，将管子和柱子的进口慢慢联上拧紧。迅速拆下柱子出口的堵头，柱子的出口有流动相流出后，将柱子的出口与管子联结好。

柱子的拆除：将泵的流速设为0.2ml/min，看到废液有流动相滴出时，把柱子出口的管子拆下。在拆下柱子出口上安上堵头，旋紧。快速松开柱子的进口，把柱子的进口用堵头旋紧。色谱柱的最大流量不能超过1.2ml/min。最大压力不超过30kg/cm2。超过这个指标，色谱柱中的填料将被系统的压力压塌陷。色谱柱报废。

四、GPCW软件的操作

4.1工作条件

下图是工作条件的编写窗口，每一个实验条件可以做相同的样品。如在测试中，我们调用条件［B］，如左图。以后生成的数据文件*.db1和*.db2。这两个数据文件是检测器1（RI）和检测器2（UV）的数据，数据处理时用FANB.cal的销正曲线。 ［滞后］1号检测器是［0］，二号检测器在检测器之前，为［＋］。［基线修正］一般为零，对于基线不稳定的检测器，最大不超过1.5。

4.2数据接收

数据采集定义

依次添好此表，以后的数据将以默认值的方式出现，建议用30 或60点/分的采点密度。第二次数据采集只要填写实验数目即可。按[继续]。

鼠标点击样品名下的白格，输入样品的名称。按[开始采集]。

[1]

手动进样器的进样信号线与接

口的进样信号连接后，进样时板动进样阀，自动开始计时。在实验快完成时，将进样阀扳回准备状态即可。

[2]自动进样器的用户，系统会按自动进样器的设置自动完成数据接收。

4.3谱图建立校正曲线

例：校正曲线名称：PS Mark How  = 0.706 Mark How K = 0.5 x 10-4 校正曲线选用方程： LgM=a0*t3+a1*t2+a2*t+a3

自动选峰阀值一般为输入标样的谱图数目双击新出现的空白条，选择标样的文件。按［确定］。



程序自动找出第一张谱图的四个峰。按［完成］直至三张谱图都选完。





依次填写每一个样品的分子量，选计算，选保存。

在此得到校正曲线的数据。按［确认］。返回上个窗口，按［保存］、［取消］。完成校正曲线编辑。

4.4分子量计算

 读出数据文件，程序会

自动读出工作条件中的校正曲线。

 可以重新挑选一条校

正曲线或输入计算时的，，让软件自行进行普适转换。 选择峰检索阀值，使单

一峰面积小于阀值的峰不被选定。 根据需要，选择原始谱

图计算还是优化谱图计算。按［确定］





移动鼠标，选择计算区间的起始点，按鼠标的左键，再移动鼠标，选择计算区间的终止点，按鼠标的左键。

如果不合理，按［选择基线］，重新选择区间。





根据需要，可以将数据进一部的平滑。

可以选择一个计算区间，使数据处理更加准确。按［开始计算］。

这是软件计算的分子量的结果和峰

计算的结果。











药典版的用户我们会按药典的要求

提供计算结果。



另：由于色谱图的波动比较大，用谱图建立校正曲线的时候会出错，请用以下方法。

在原始谱图中先选出标样的蜂位，在回到校正曲线，键盘建立校正曲线。添好校正曲线名，数据个数，曲线次数。再将峰位和标样的分子量添入。选计算，显示，保存即可。