植物组织特异性启动子的研究进展
植物组织特异性启动子的研究进展
摘要:组织特异性启动子也称器官特异性启动子(organ specific promoter) ,可调控基因只在某些特定的部位或器官中表达,并往往表现出发育调节的特性。本文介绍了植物组织特异性启动子中的花、果实、种子及叶特异性启动子,并对植物组织特异性启动子研究中问题进行了讨论和展望。
关键词:植物组织特异性启动子,研究进展
启动子(promoter)是RNA 聚合酶能够识别并与之结合从而起始基因转录的DNA 序列,是重要的顺式作用元件,位于结构基因5’端上游区的DNA 序列,能指导全酶与模版的正确结合,活化RNA 聚合酶,并使之具有起始特异性转录的形式,决定转录的方向和效率以及所使用的RNA 聚合酶类型,是转录调控的中心。目前,植物基因工程中常用的启动子为组成型表达启动子(Constitutive promoter) 。组织特异性启动子也称器官特异性启动子(organ specific promoter) ,可调控基因只在某些特定的部位或器官中表达,并往往表现出发育调节的特性。外源基因在细胞中表达是基因工程研究的关键,而组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累,增加区域表达量,同时也可以避免植物营养的不必要浪费。因此,组织特异性启动子一直都是植物基因工程中研究的重点和难点,研究者在植物的分生组织、维管束组织、薄壁组织、花粉、种子和胚乳等几乎各种组织中都发现有组织特异性驱动基因表达的启动子[1],尤其在根、维管束和韧皮部特异表达启动子研究中取得了很大进展。
1 植物生殖器官表达的组织特异性启动子
1.1 花特异启动子
高等植物发育过程中花器官的形成是一个十分复杂的过程,它包括一系列器官分化及严格控制的细胞及生化变化,同时伴随大量基因的协同表达。植物花特异表达启动子只在植物开花的时期启动基因的表达,它的分离克隆为花卉的品质改良提供了重要的顺式调控元件。
人们克隆了许多花药特异表达的基因,如在花药绒毡层特异表达的TA29[2]和A9[3]以及在花粉壁特异表达的Bp4A [4]基因等,这些基因都是在花药营养细胞 中表达,与生殖细胞的分化无关。Mariani 等将烟草花药绒毡层特异表达基因启动子TA29分别与核酸酶Bamase 和RnaseTl 基因融合后转化植物,这两种核酸酶基因在花药中特异表达,破坏绒毡层,获得雄性不育烟草和油菜[5,6],开创了基因工程创造雄性不育系的先河,至今已在烟草[7]、油菜[8]等植物上获得成功。还有在花药中特异表达的基因,如拟南芥和油菜的APG 基因等。在花粉中特异表达的基因如:玉米的 Zm13 (蛋白酶抑制剂) 、CDPK (钙依赖型蛋白激酶)、番茄的LAT52、LAT 59及油菜Bp4 、I3 、E2和 F2s 等。
近年来人们相继分离和鉴定了许多花特异表达基因的启动子,如矮牵牛和金
鱼草的类黄酮合成相关的一些基因(CHSA、CHSJ 、CHIB 、CHIA2) 的启动子。其中对查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS) 基因家族的查尔酮合酶基因启动子的研究较为深入,CHs 是类黄酮类物质生物合成途径中的关键酶,它催化3个分子的丙酚辅酶A(malonyl CoA) 与1个分子的香豆酰辅酶A(eoumaryl CoA) 生成4,5,7-三羟基黄烷酮(narigen-inchalcone)。类黄酮类物质是广泛存在于高等植物中的次生代谢物,与植物的花色形成密切相关,并在植物与环境的相互作用中起重要作用,如防止紫外损伤、抗病、影响豆科植物的根瘤形成等[9]。
1.2 果实和种子特异启动子
特异性启动子调控基因表达,不仅可提高基因在这些部位的表达量,而且可有目的地提高转基因植物果实或种子的品质。
目前已获得的果实特异型启动子主要有E8、2A11、2A12、PG 、MCP I、B33和ACC 氧化酶启动子等。毛自朝等用PCR 方法获得了番茄果实专一性启动子2A12和农杆菌C58 Ti 质粒上的ipt 基因,经农杆菌介导转入番茄品种“中蔬4号”的基因组中。Beta-glucuronidase(GUS,β-葡糖苷酸酶) 组织化学活性分析表明:2A12启动子具有严格的果实表达专一性;转基因果实中细胞分裂素的含量增加,最终导致果实中种子发育的停滞和胎座组织的增厚,并形成无籽番茄果实;果实采后的储藏保鲜时间延长1-2周[10]。如Krasnyanski 等[11]将E8启动子与报道基因
uidA 相连,导入番茄中,在T0、T1代植株果实和叶子中分析β-葡糖醛酸糖苷酶,发现E8控制的uidA 基因只在番茄果实里表达。Obiadalla-Ali 等采用反义RNA 技术,将B33启动子控制的马铃薯果糖-1,6-磷酸酶基因转入番茄中,使其在果实中特异性表达。结果表明,番茄叶绿体中果糖-1,6-磷酸酶活性被抑制,完全成熟的果实的平均重量减少20%,而其他碳水化合物,如葡萄糖、蔗糖等变化很小。说明可以利用果糖-1,6-磷酸酶的反义RNA 技术获得迷你型番茄。
另外一个问题是,果实特异启动子控制外源基因表达的效果有时并不理想。例如Krasnyanski 等[11]将花椰菜花叶病毒 (cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S启动子与苜蓿(Madicago sativa)花叶病毒的5’ 不翻译前导序列连接, 构成组成型启动子CaMV 35S/AMV,将其与E8启动子分别转入番茄中中,GUS 活性分析显示:CaMV 35S/AMV控制报道基因的表达远远高于E8启动子。
种子特异性启动子分为与淀粉合成有关的种子特异启动子和与蛋白质合成有关的种子特异启动子。与淀粉合成有关的种子特异启动子主要有gbss Ⅰ、SBE 1和AGP 小亚基基因启动子等。目前发现的与种子中贮藏蛋白质有关的启动子主要有球蛋(globulin )启动子、谷蛋白(glutelin )启动子、醇溶谷蛋白(prolamine )启动子、USP 启动子和napin 启动子等。研究较多的是胚乳特异性谷蛋白基因启动子。人们希望通过植物基因工程提高植物中所含的营养物质。水稻谷粒中含有铁蛋白,但多积累在糊粉层,在谷粒加工过程中会失去很多铁。Vasconcelos 等[12]用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因,使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加,而且铁蛋白主要积累在胚乳中,不会在食品加工过程中丢失。
因为种子特异性启动子可以控制外源基因在种子中的特异表达,有些外源基因的产物在种子中的大量积累,有可能会影响到种子的萌发等特性。
在有些情况下,利用种子特异启动子控制外源基因表达的效果并不比组成型启动子好。Lee 等[13] 2001年分别将35S 启动子和水稻谷蛋白GluB-1启动子控制下的赖氨酸反馈迟钝玉米的二氢吡啶合成酶基因分别导入水稻中,结果发现,35S 启动子控制的转基因水稻中dhps 的转录本和种子中DHPS 的活性比GluB-1启动子控制的转基因水稻中的高。两种转基因植物中未成熟种子中自由赖氨酸的含量均比野生型的高。35S 启动子控制的转基因水稻的成熟种子中自由赖氨酸的含量比野生型高,GluB-1启动子控制的转基因水稻的成熟种子中自由赖氨酸的含量和野生型的相同。比较DHPS 和赖氨酸酮戊二酸还原酶的表达水平,可以看出外源dhps 基因的表达导致LKR 活性增加,使赖氨酸水平上升,但是35S 启动子控制下dhps 的过量表达可以提高种子中赖氨酸的含量。这就表明,如要增加水稻籽粒中赖氨酸的含量,利用35S 启动子的效果比GluB-1启动子更好。
2 植物营养器官表达的组织特异性启动子
2.1 根、茎特异表达启动子
根、茎是植物体吸收、运输水分和营养物质的重要器官。根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。应奇才等克隆乔松的根特异性启动子PmPgPR10驱动胆碱单氧化物酶基因(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)并转入水稻,对转基因植株根和叶的CMO 酶、BADH 酶活性及其他生理生化指标进行了测定。结果表明:CMO /BADH 双价基因可在根部特异性表达
[14]。茎特异表达系统一般包括:韧皮部特异表达启动子、维管束特异表达启动子、块茎特异表达启动子[15]。对这类启动子结构与功能的研究将为植物基因工程的研究提供启动元件。蒋浩等首次证明笋瓜PP2基因启动子可驱动外源基因在异源植物韧皮部及分生组织中特异性表达。研究比较深入的维管束特异表达启动子主要有:菜豆富甘氨酸细胞壁结构蛋白(GRPll8)基因、拟南芥维管束特异表达profilin2基因和菜豆苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)基因的启动子。马铃薯颗粒结合淀粉合成酶(granule-bound starch synthase, GBSS)基因在各器官中均有表达,但在块茎与匍匐茎中最高。经研究表明马铃薯GBSS 基因启动子驱动的GUS 基因在匍匐茎和块茎中的表达比叶片高125~350倍,且高浓度蔗糖等因素可诱导GBSS 基因高水平表达[15 ]。
2.2 叶特异表达启动子
植物叶特异表达顺式元件具高度保守性,Taniguchi 等[16]在玉米中发现了一个双元启动子系统(dual promoter system)。PPDK(pyruvate orthophosphate dikinase)是C 4植物光合反应中的一个叶绿体酶,该酶基因Pdk 具有一个双元启动子系统(C4Pdk 启动子和细胞质Pdk 启动子) 。这两个启动子的区别在于起始密码子和拼接方式的差异,C 4Pdk 启动子驱动Pdk 转录成较长的mRNA ,基因产物定位在叶绿体中;细胞质Pdk 启动子在Pdk 基因的第一个内含子中,驱动Pdk 转录成较短的mRNA ,它所编码的蛋白质定位于细胞质中,又称为细胞质Pdk 启动子。
C 4Pdk 启动子是受光诱导的强启动子,驱动基因在玉米叶肉细胞中特异表达,而细胞质Pdk 启动子是个弱启动子,且不具有组织特异性。大多数C 4植物的光合作用相关基因的表达具有细胞特异性,且主要在转录水平调节基因表达活性。因此,可利用该启动子在植物叶肉细胞中高效表达外源基因。
3 植物组织特异性启动子的问题及研究展望
启动子是精确调控外源基因在植物体内表达的“开关”。随着转基因技术的广泛应用,快速分离和鉴定植物体内各种特异启动子已经成为植物基因工程研究的热点和难点。近年来,植物种子特异性启动子的研究和应用有了很大的提高,但是在应用过程中也出现了一些新的问题。一些种子特异启动子除了使外源基因在种子中表达,还可以使外源基因在植物的其他部分异位表达[17,18]。另外,种子特异性启动子由多个元件控制,调控机制复杂。种子特异性启动子能否驱动外源基因在转基因植物中正确表达,表达时间和空间严格遵循种子特异性,启动子的哪些序列参与了表达与调控,顺式作用元件与反式作用因子如何协调,能否跨越种属间隔进行调控,采用何种方法保证转基因植物种子的顺利萌发,或避开由种子萌发获得实生苗的途径而通过组织培养等方式使外源基因在子代中顺利表达等,这些问题有待于进一步研究和解决。
近几十年来人们在组织特异性启动子研究方面展开了大量的工作,不仅克隆了数量丰富的组织特异性启动子,而且对其结构和功能有了一定的认识。随着植物基因工程技术的发展,根据需要选择或人工构建合适的启动子,利用双向表达启动子结合基因融合技术和基因叠加技术,不仅便于研究新基因的功能,而且可以成倍提高转基因工作的绩效,在植物特定的部位或发育阶段生产有用蛋白质或其他代谢产物,实现对外源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控。组织特异性启动子作为一种重要的顺式作用元件在生物反应器的研发以及在抗虫、抗病、抗旱、抗高渗胁迫等抗逆特性的转基因植物优良品种选育等方面,将会得到 更加广泛的应用。
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