测定紫甘薯花青素含量
2012年25卷1期Vol. 25No. 1西南农业学报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
123
文章编号:1001-4829(2012)01-0123-05
高效液相色谱法测定紫甘薯花青素含量
毛建霏,周
*
虹,雷绍荣,郭灵安,欧阳华学,代晓航
(四川省农业科学院分析测试中心,农业部食品质量监督检验测试中心,四川成都610066)
摘要:本文建立了紫甘薯中花青素的高效液相色谱-紫外定量检测方法。使用盐酸水溶液超声提取紫甘薯花色苷,沸水浴将多
种花色苷水解为花青素单体。采用高效液相色谱-紫外可见检测器对紫甘薯中主要花青素矢车菊和芍药素进行定量检测。结果仪器定量限26.7ng /mL,仪器检出限8.0ng /mL,方法检出限0.80mg /kg,日内表明:矢车菊素线性范围0.0454~90.8μg /mL,
RSD 1.8%,回收率97.8%~100.7%;芍药素线性范围0.0420~80.4μg /mL,仪器定量限24.7ng /mL,仪器检出限7.4ng /mL,方法检出限0.74mg /kg,日内RSD 2.4%回收率93.7%~95.5%。该方法便捷准确,可将紫甘薯及其他作物中复杂花色苷水解为花青素单体进行定量测定。
关键词:高效液相色谱;紫甘薯;花色苷;花青素;矢车菊;芍药素;提取;水解中图分类号:S531
文献标识码:A
Detection of Anthocyanins Content in Purple Sweet Potato
by High Performance Liquid Chromatographic
MAO Jian-fei ,ZHOU Hong ,LEI Shao-rong *,GUO Ling-an ,OUYANG Hua-xue ,DAI Xiao-hang
(Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences ,Food Quality Inspection and Supervision Center of Agricultural Ministry ,Sichuan Chengdu 610066,China )
Abstract :In this paper ,a high performance liquid chromatographic method was estabolished for the quantification of anthocyanins in purple sweet potato.After extracted under the ultrasonic irradiation in HCl aqueous solution ,the anthocyanins were directly hydrolyzed into major anthocyanidins ,of which cyanidin and peonidin were quantified by HPLC-UV /VIS.The result showed that Cyanidin had excellent linear rela-tionship in the studied range of 0.0454-90.8μg /mL,with the instrument quantification and detection limits of 26.7and 8.0ng /mL,the recovery rate of 97.8%-100.7%,the method detection limit of 0.80mg /kgand intra day RSD of 1.8%.Peonidin indicated excellent linear relationship in the studied range of 0.0420-80.4μg /mL,with the instrument quantification and detection limits of 24.7and 7.4ng /the method detection limit of 0.74mg /kg,and intra day RSD of 2.4%.The method was feasi-mL ,the recovery rate of 93.7%-95.5%,
ble and accurate ,thus it was able to routinely determine the anthocyanidins hydrolyzed from various anthocyanins in purple sweet potato and other plants.
Key words :HPLC ;Purple sweet potato ;Anthocyanins ;Anthocyanidins ;Cyanidin ;Peonidin ;Extraction ;Hydrolysis
[1,17]
花青素是一类自然界广泛存在的水溶性天然色
素,多以糖苷化和酰基化的形式存在,称为花色苷,已鉴定出上千种
[1~2]
。紫甘薯富含花青素类色素,
。由于糖苷化和酰的酰基化衍生物形式存在
基化方式的多样性,紫甘薯中花色苷种类复杂,难以
[18]
进行定量检测,目前紫甘薯花青素的检测方法大都仅是定性分析和色谱法。
[19~20]
近年来的研究表明,紫甘薯色素具有多种生理功能,
[1,3~16]
。紫甘薯花青素的主要成分是市场前景广阔
矢车菊素和芍药素及少量的天竺葵素,以糖苷化后
收稿日期:2011-06-20
“紫甘薯中花青素的测定”基金项目:四川省地方标准
作者简介:毛建霏(1983-),男,硕士学位,主要研究方向液相
*为通讯作者。色谱分析,
,主要有紫外可见分光光度法
可见分光光度法定量测定花青素目前主要有
pH 示差法[21]及亚硫酸钠漂白法[22~23]。pH 示差法根据不同pH 条件下花青素结构不同,可见光谱发生变化来测定花青素色素含量。但花色苷的颜色不但受花青素核上取代基的位置、糖苷和酰基的种类和数量的影响,还受到提取液中辅色剂、金属离子等
的影响[24]
。由于生物样品的复杂性,难以通过简单的pH 调节将其完全转化成无色假碱、半缩醛及查
尔酮形式
[24]
。在弱酸条件下利用花青素与亚硫酸
钠反应后,亚硫酸根离子在花青素核的C-4位与花青素核生成无色化合物后[25]
,花青素核在可见光区的特征吸收消失,而紫外区的吸收基本不变,使用矢车菊为标准品对紫甘薯总花青素含量进行了测定[22]
。然而,
由于亚硫酸钠漂白选择性不好,并且弱酸条件下游离花青素稳定性欠佳,以及没有考虑
辅色剂、金属离子等对花青素紫外可见吸收的影响,该法还需要进一步深入研究。
高效液相色谱法是准确测定紫甘薯花青素的最佳手段之一。由于紫甘薯色素成苷方式和酰基化的多样性,采用色谱法直接测定需要复杂的仪器和多
种标准品,成本昂贵[17,26~27]
。目前已报道紫甘薯中超过二十种花色苷,直接测定需要超过二十种标准
品,难以用于实际检测工作。已有高效液相色谱分离紫甘薯花青素的报告,但均未给出具体的花青素
结构和含量,只给出了相对峰面积[20,27~28]
。通过水解多种紫甘薯花色苷为少数花青素单体,可以方便准确的对花青素含量进行定量分析,
从而降低检测成本,简化检测步骤。由于自然界花青素以更稳定
的花色苷形式存在,首先需要考虑花青素单体的稳定性。最近Truong 等报道可采用提取-水解法对紫甘薯花青素含量进行了定量检测,证明紫甘薯花色苷和花青素在强酸水解条件下能够保持稳定。但其采用较繁琐的分步提取,水解和真空干燥,并且没有对水解条件进行优化也未对方法进行验证
[1]
。
本文使用盐酸超声快速提取紫甘薯中花青素并直接
将花色苷水解为花青素,建立了紫甘薯中花青素的高效液相色谱-紫外定量检测方法。该法方便、快速、准确,样品经提取水解,直接使用高效液相色谱进行分离测定,使用少数种类的花青素即可对紫甘薯花青素进行准确定量测定。
材料与方法
1.1
供试材料
紫甘薯干粉,120目,购于当地市场;矢车菊素
(Chromadex ,标准品,纯度95.7%);芍药素(Chro-madex ,标准品,纯度92.5%);浓盐酸(西陇化工,优级纯);乙腈(Fisher Scientific ,HPLC 纯);甲醇(Fisher Scientific ,HPLC 纯);甲酸(TEDIA ,HPLC 纯);实验用水均为去离子水。1.2
仪器与设备
Waters e2695高效液相色谱仪;Waters 2998紫
外-可见光电二极管阵列检测器,
用于花青素光谱扫描;Agilent1200高效液相色谱仪,
Agilent G1314B 多波长紫外检测器,用于花青素测定;超声机(Hen-gao T&D,HS10260D );电子天平(Mettler ,AE240);
实验室超纯化水机(艾科浦,ACD1-2005-U )。1.3试验方法1.3.1
样品处理
取紫甘薯干粉样品1.00g 于
250mL 磨口锥形瓶,加入3mol /L盐酸水溶液60mL ,超声提取30min 后沸水浴中回流冷凝水解1h 。立即避光冷却后,定容至100mL 。摇匀后静置约5min 后直接取上层清液过0.22μm 聚醚砜滤
膜,使用高效液相色谱仪进行分析。1.3.2
液相色谱条件色谱柱:waters SunFire C18,5μm ,4.6×250mm ;柱温:30℃;检测器及波长:525nm ;流动相A :1%甲酸/水溶液(体积
比),过0.2μm 水系微孔过滤膜;流动相B :1%甲
酸/乙腈溶液(体积比);流动相流速:0.46mL /min;梯度条件:0~15min A 相从95%线性变化至55%,保持5min 后,5min 内变为95%并平衡5min ,共30min 。
2
结果与分析
2.1
紫甘薯花青素前处理条件选择
紫甘薯花色苷糖苷化和酰基化后稳定性增加,稳定性优于同类色素。通常游离花青素的稳定性不佳,在中性和碱性条件下迅速分解。但在强酸条件下能稳定存在。最近有研究表明游离花青素能够耐
受前处理过程中的加热和水解
[1,29]
。超声处理能够加快花色苷的提取,
使用强酸超声提取后可直接进行水解,避免了萃取过程中的损失。此外,由于紫甘薯干粉含有大量淀粉,在强酸条件下淀粉也发生水解,有利于花青素的充分提取。这里使用3mol /L的盐酸超声提取半小时后水解1h ,定容上机。前处理过程迅速,简便,易于推广。在前处理过程中应避
免强光照射,
防止花青素降解。样品完成前处装瓶后,6h 后矢车菊素和芍药素峰面积分别下降至初
始峰面积的97.2%和95.4%。因此,前处理后样品应在6h 以内完成测定。2.2液谱条件选择
当溶液pH 大于3时,花青素单体稳定性差。因此花青素分析需要使用酸性较强的流动相,结合当前的文献和前期的工作,这里选择酸性较强的1%甲酸水溶液和乙腈溶液。色谱柱选择waters 的SUNFIRE C18色谱柱,该色谱柱的优点是可在酸性条件下长时间稳定使用。
图1为矢车菊素和芍药素在该液相色谱条件下的矢车菊素浓度和芍药素浓度分别为4.54和
1
因此该液相色谱方法具有良好的稳定性和精密度。2.3线性范围、定量限、检出限、精密度通常认为游离花青素稳定性不好,因为在pH3
Dao 等以上和光照条件下花青素降解迅速。例如,
发现在0.01%盐酸的酸性甲醇中的花青素几天之
[30]
内迅速降解,因此游离花青素的准确测定受到限制。然而,这里发现使用10%浓盐酸甲醇溶液(体
经过3个月的检测积比)避光-20℃保存条件下,观察,矢车菊及芍药素仍然未发生降解。因此,标样有效期在3个月以上。使用时使用3mol /L盐酸水溶液将储备液稀释成所需浓度的系类工作液进行标
节约准曲线绘制。从而避免了储备液的频繁配置,
图1
Fig.1
矢车菊和芍药素液相色谱图(A )及矢车菊素(B )、芍药素(C )紫外可见光谱图
HPLC chromatogram of cyaniding and peonidin (A )and UV-VIS absorption spectrums of cyanidin (B ),peonidin (C )
了检测成本。同样是酸条件下,有机相比例高的标
样的稳定性大于水相样品中的花青素,原因尚不清楚,有待进一步研究。
分别配制矢车菊素工作液0.0454~90.8μg /mL ,芍药素0.042~80.4μg /mL的工作液进行分析。数据分析使用Agilent 工作站进行,仪器定量限和检出限分别对应仪器10和3倍信噪比。在所研究的范围内矢车菊素和芍药素的线性关系良好。线
相关系数、仪器定量限、仪器检出限、方法检性关系、出限见表2。
在该条件下,对该紫甘薯干粉样品进行6次平
行测定,矢车菊的含量411.6mg /kg,RSD 为1.8%,RSD 为2.4%,芍药素含量912.9mg /kg,精密度良好。紫甘薯花青素本底含量较高,该方法定容体积较大,前处理过程未涉及溶液的萃取、转移,并且自然状态下紫甘薯中花青素以花色苷形式存在,市场上未见其标准品出售,因此准确度重点考察了矢车菊素和芍药素在该方法条件下的稳定性。在在
4.20μg /mL时的液相色谱图和紫外可见光谱图,矢车菊素和芍药素的最大吸收波长均为525nm ,从而选择其作为检测波长。
等度洗脱即可使矢车菊素和芍药素得到良好的分离,但是由于花青素为水溶性色素,所用流动相洗脱强度较弱。考虑到这里没有进行净化处理,因此
避免杂质降采用梯度洗脱一方面使杂质得到洗脱,
低柱效,峰形变差,带来测定误差。另一方面,等度通过梯度洗脱矢车菊和芍药素保留时间差异较大,洗脱使得两者的峰形改善,灵敏度得到提高。在所
使用液相色谱条件下,在矢车菊素4.54μg /mL,芍药素4.20μg /mL水平,矢车菊峰面积变异系数0.77,保留时间变异系数0.13;芍药素峰面积变异系数0.20,保留时间变异系数0.16,具体数据见表1。
表1
Table 1
花青素Anthocyanidins 矢车菊Cyanidin 芍药素Peonidin
浓度(μg /mL)Concentration
4.544.20
矢车菊和芍药素的峰面积和保留时间变异系数
峰面积变异系数c.v .of peak
area
0.770.20
保留时间变异系数c.v .of retention
time
0.130.16
Coefficients of variation of the peak area and retention time of cyanidin and peonidin
峰面积mAU 290.8,294.3,296.7295.6,295.3,295.5496.0,495.9,496.7,495.4,494.0,495.6
保留时间(min )
Retention time 14.815,14.849,14.84714.813,14.814,14.82715.872,15.916,15.92015.868,15.875,15.890
表2
Table 2
花青素
Anthocyanidins 矢车菊Cyanidin 芍药素Peonidin
矢车菊和芍药素的线性关系和方法检出限
相关系数Instrument quantification
limits 0.999970.99987
仪器定量限(ng /mL)Instrument detection limits
26.724.7
仪器检出限(ng /mL)Method detection limits
8.07.4
方法检出限*
(mg /kg)Method detection limits
0.800.74
Regression analysis of calibration curves and method detection limits of cyaniding and peonidin 线性关系Linear regression
equation
y =74.29448x -15.79336y =119.43568x +6.37652
注:*方法检出限以称样量1.00g ,定容体积100mL 进行计算。
矢车菊素4.54μg /g,芍药素4.20μg /g水平,进行5次测定。矢车菊和芍药素的试剂添加回收率分别为97.8%~100.7%和93.7%~95.5%,准确性与稳定性良好,与文献基本一至实可行。
[1,29]
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3小结与讨论
采用盐酸超声提取-沸水浴水解法,使用高效
液相色谱/紫外-可见检测器,建立了紫甘薯花青素的定量检测方法。矢车菊素线性范围0.0454~90. 8μg /mL,线性相关系数0.99997,仪器定量限26.7ng /mL,仪器检出限8.0ng /mL,方法检出限0.80mg /kg,日内RSD 1.8%,回收率97.8%~100.7%;芍药素线性范围0.042~80.4μg /mL,线性相关系数0.99987,仪器定量限24.7ng /mL,仪器检出限7.4ng /mL,方法检出限0.74mg /kg,日内RSD 2.4%,回收率93.7%~95.5%。该方法简便稳定,可作为紫甘薯及其他花色苷种类复杂的植物中花青素的常规定量分析方法。参考文献:
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(责任编辑陈虹)