微生物代谢工程
一.代谢控制发酵
代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法,人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢,使得目的产物大量的生成、积累的发酵。
代谢控制发酵的核心:解除微生物代谢控制机制,打破微生物正常的代谢调节,人为地控制微生物的代谢。
二 微生物代谢工程定义,研究内容和研究手段
目前代谢工程较系统的定义如下:
应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作,改变酶的功能或输送体系的功能,甚至产能系统的功能,以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作(包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现)。简而言之,代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。
代谢工程的研究内容
1 代谢流的定量和定向
(1)流量评计原理
A 基于模型动力学B 控制理论C 示踪实验D 磁化转移F 代谢平衡
(2)代谢流的定向A 利用环境控制B 改变细胞组成的控制 C 代谢流向的目标产物的增加 2 (1)转运过程的生物化学
A 转运蛋白机制:载体通道泵 B 转运动力学C 载体媒介转运的能量方面:偶联的概念
D 细胞转运活性的调节
(2)研究方法方面
A 转运过程的实验分析B 扩散和载体媒介转运间的区别C 转运过程动力学分析
D 生物过程中的转运分析E 公认控制步骤的转运
3
(1)用于胞内核磁共振研究的反应工程(2)胞内代谢物分析快速反应取样的反应工程 4 用13C标记实验进行胞内稳态流分析
(1)稳态流分析(2)测定稳态胞内数据(3)代谢物13C标记系统的模型
(4)模拟和数据分析(5)稳态标记系统的综合分析
代谢工程的研究手段
1 采用遗传学手段的遗传操作:(1)基因工程技术的应用(2)常规诱变技术的应用
2 生物合成途径的代谢调控:(1)生物合成中间产物的定量生物测定(2)共合成法在生物合成中的应用(3)酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏(4)无机磷对生物合成的调节
3 研究生物合成机制的常用方法:(1)刺激实验法(2)同位素示踪法(3)洗涤菌丝悬浮法(4)无细胞抽提法(5)遗传特性诱变法
三.工业发酵的五字策略(图示加文字说明)
①进,促进细胞对碳源营养物质的吸收;
②通,使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物;
③节,阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流,使碳架物质相对集中地流向目的产物;
④堵,消除或削弱目的产物进一步代谢的途径;
⑤出,促进目的产物向胞外空间分泌。
P 通 堵
四.酶的阻遏机制,以大肠杆菌色氨酸或组氨酸操纵子为例来说明(图示加文字说明) 1 末端代谢产物阻遏
这是酶合成阻遏中的一种。它是指由于末端产物的过量积累而引起代谢途径中酶合成的阻遏,是一种反馈阻遏,末端代谢产物阻遏的特点是同时阻遏合成途径中所有酶的合成。 对于分支代谢途径的末端代谢产物阻遏,每种末端产物只专一地阻遏合成它自身那条分支途径的酶,而分支点的酶则受所有分支途径末端产物的共同阻遏。这种几个终产物,共同协调阻遏某一个酶的生物合成称为多价阻遏
对于直线式代谢途径,末端产物阻遏情况较为简单。末端产物将引起代谢途径中各种酶的合成终止。末端代谢产物阻遏的机制可以用操纵子学说解释。如大肠杆菌色氨酸操纵子模型。
所谓分解代谢阻遏,是当细胞中具有一优先利用的底物时,很多其他分解反应途径受到阻遏的现象。由于这种阻遏并不是优先利用底物及作用的结果,而是有底物分解过程中产生的中间代谢物引起的,所以称为分解代谢物阻遏。
结构:E.coli的色氨酸操纵子有五个结构基因,E/D/C/B/A基因,编码色氨酸合成的相关酶。上游调控区由启动子P和操纵元件O组成,R是调节基因,编码阻遏蛋白。在O与E
基因
之间由一段编码衰减子的L基因。
阻遏机制:色氨酸操纵子负责调控色氨酸的生物合成,它的激活与否完全根据培养基中有无色氨酸而定。无色氨酸存在时,阻遏蛋白不能与操纵元件结合,对转录无抑制作用。
细胞内有较大量色氨酸时,阻遏蛋白与色氨酸形成复合物后能与操纵元件结合,抑制转录。色氨酸在这里不是起诱导作用而是阻遏,因而被称作辅阻遏分子,意指能帮助阻遏蛋白发生作用。色氨酸操纵子恰和乳糖操纵子相反。
五.协同反馈抑制,以谷氨酸产生菌(棒杆菌或短杆菌)天冬氨酸族氨基酸代谢途径中反馈调节为例来说明(图示加文字说明)
协同反馈抑制是指分支代谢途径中几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制和阻遏。
六.营养缺陷型和结构类似物抗性突变株(以氨基酸产生菌为例)如何选育获得?
对于营养缺陷型菌株,由于代谢途径中某一步骤发生缺陷,在直线式的代谢途径中,则只能累积中间代谢物而不能累积末端代谢产物,但末端代谢产物对菌体的生长仍是必需的,在分支代谢途径中,就可以累积另一分支途径的末端代谢产物。
在赖氨酸发酵生产中,为了解除正常的代谢调节的获得赖氨酸的高产菌株,人们选育了谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型菌株作为赖氨酸的发酵菌种。该菌种由于不能合成高丝氨酸脱氢酶(HSDH),故不能合成高丝氨酸,也不能合成苏氨酸和蛋氨酸,在补充适量高丝氨酸(或苏氨酸和蛋氨酸)条件下,该菌株就能大量产生赖氨酸。
谷氨酸产生菌如果诱变获得抗苏氨酸(α-氨基-β-羟基丁酸)和异亮氨酸的结构类似物AHV(α-氨基-β-羟基戊酸)突变株,进行发酵,就能分泌较多的苏氨酸或异亮氨酸,这是因为该菌的关键酶(或称调节酶/变构酶)的结构基因发生了突变,不再受苏氨酸或异亮氨酸的反馈调节,使得苏氨酸或异亮氨酸大量积累。
七.以初级代谢产物乙醇(利用包括葡萄糖等各种原料)或1.3-丙二醇为例简述微生物代谢设计育种方案。
微生物的育种方案是:
① 出发菌种的选定
调节机制简单;遗传标记可靠; 生长情况良好;有目的产物的生产潜力; 可以获得;经费方面可行
② 遗传操作方案的制定
物理诱变; 化学诱变; 复合诱变;定向诱变; 插入基因拷贝;插入途径基因组 ③ 遗传操作方案的实施
缺陷型突变株的获得; 结构类似物抗性突变株的获得; 结构类似物超敏性突变株的获得; 分子生物学方法
④ 变异株培养条件的优化
许多细菌、真菌和高等植物中都存在由丙酮酸生成乙醇的途径,它为厌氧条件下的糖酵解途径起着再生NAD+的重要作用。其中,丙酮酸脱羧酶(PDC)催化丙酮酸的非氧化脱羧反应,形成二氧化碳和乙醛;后者在乙醇脱氢酶(ADH)的作用下转变为乙醇。由于丙酮酸在糖酵解途径中是个关键的节点,与草酰乙酸、乙酰辅酶A、乳酸等合成途径均有密切联系,因此通过强化表达细胞内PDC和ADH的活性来扩增目标途径,是构建高产乙醇基因工程菌的主要战略。
微生物菌种利用广谱碳源和能源能力的拓展是设计和改进发酵过程的一项基本内容,这对于那些底物成本在生产总成本中占有重大比例的大规模生产过程尤为重要。乙醇生产的底物成本为60%~65%。由于大多数微生物共享种类齐全的公共代谢途径,因此底物范围的拓展操作通常只需加入有限的几种酶反应即可实现。然而在偶然情况下,这些所引入的步骤需要与下游反应相协调,这对 代谢工程的设计提出了很高的要求。
乙醇可以从许多可再生的原材料制得,包括含糖作物甘蔗、甜高粱和含淀粉谷物玉米、小麦等,以及木质纤维素类物质如农业废料、草类和木材等
1、酵母菌属乙醇发酵途径的改良
发酵生产乙醇的微生物最好能利用所有存在的单糖,此外还必须抵抗原料水解物中存在的任何潜在抑制剂。最常见的乙醇发酵菌种为酿酒酵母以及发酵单胞菌属(Zymomonas),能从葡萄糖生产较高浓度的乙醇,但它们不能发酵纤维素和木糖,而后者在原料中的含量高达8~28%。因此,利用这两类微生物从纤维素类物质生产乙醇,必须首先将这些物质进行液化和糖化预处理。此外,酵母菌发酵阿拉伯糖的能力也极弱。早期有人将来自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的木糖异构酶基因克隆到酿酒酵母中,但这种只移植一步途径的尝试没有获得成功,原因是异源蛋白在重组菌细胞内没有表达出相应的活性。
2、运动发酵单胞菌中戊糖代谢途径的引入
将乙醇合成基因引入肠道细菌,同时在天然乙醇生产菌株(如酿酒酵母和运动发酵单胞菌)中引入来自其他微生物种属的戊糖代谢途径,这是构建理想的乙醇生产菌的主要内容。
3、利用基因重组工程技术改良酵母菌属乙醇发酵过程的内容还包括提高酿酒酵母对木质纤维素水解物中酚抑制剂的抗性。在最近的一项研究中,将来自白色腐烂真菌Trametes versicolor的漆酶(Laccase)编码基因置在PGKl启动子的控制下,并转化酿酒酵母。结果表明,漆酶的过量表达赋予了克隆菌对木质纤维素水解物中酚抑制剂的高耐受性,从而改善了酿酒酵母由可再生原材料生产乙醇的产量。
4、一般而言,微生物代谢木糖到木酮糖通过两条分离的路线:由木糖异构酶催化的一步途径在细菌中是典型的,而涉及木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的两步反应通常发现在酵母菌中。在运动发酵单胞菌中,5-磷酸木酮糖进入特征性的ED途径进一步代谢。最近几年来,编码木糖利用酶系的基因相继被克隆和鉴定,但是筛选分离能利用木糖的天然产乙醇微生物的努力却没有成功,这推动了将木糖利用基因引入乙醇产生菌以及具有较高乙醇耐受力的菌株中的研究工作。
八.如何采用代谢工程进行氨基酸(如赖氨酸和苏氨酸)育种
野生型的棒杆菌或短杆菌只能合成少数几种的氨基酸并将之分泌至细胞外,诸如谷氨酸、缬氨酸、脯氨酸、谷酰胺和丙氨酸。为了在细胞外大量积累所需氨基酸,改变细胞代谢流及其调控机制是必要的。使用营养缺陷型突变株可克服细胞的反馈抑制,或者使细胞内反馈抑制剂或阻遏物的浓度最小化,或者修饰抑制剂结合位点,从而提高酶对抑制剂的不敏感性。目前,绝大多数的氨基酸生产均已采用营养缺陷型和调控突变型的菌株,
与其他多种革兰氏阳性菌不同,谷氨酸棒杆菌能够识别包括革兰氏阴性菌在内的许多原核细菌的外源基因表达调控元件,大量的外源基因在这种细菌中获得高效表达,而且谷氨酸棒杆菌的氨基酸生物合成基因顺序组织也与大肠杆菌等革兰氏阴性菌具有显著的相似性,这为高产氨基酸的途径工程菌构建创造了有利条件。
从理论上来讲,氨基酸工程菌的构建战略有下列几种策略:第一,借助于基因克隆与表达技术,将氨基酸生物合成途径中的限速酶编码基因导人生产菌中,通过增加基因剂量和(或)更换表达调控元件,强化其表达。导入的限速酶基因既可以是生产菌自身的内源基因,也可以是来自非生产菌(如大肠杆菌)的外源基因。第二,采取类似的方法,强化表达氨基酸输出系统的关键基因,或者降低某些基因产物的表达速率,最大限度地解除氨基酸及其生物合成中间产物对其生物合成途径可能造成的反馈抑制。第三,将一种完整的氨基酸生物合成操纵子导入另一种氨基酸的生产菌中,构建能同时合成两种甚至多种氨基酸的工程菌。
出发菌株的选择:
要求代谢比较简单的细菌(如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等)
1)优先合成的转换:渗漏缺陷型的选育。
2)切断支路代谢:营养缺陷型的选育。
3)抗结构类似物突变株的选育(代谢调节突变)。
4)代谢互锁
解除代谢互锁的方法:
①选育亮氨酸缺陷型菌株,或者以抗AEC的赖氨酸的生产菌为出发菌株,经诱变得到抗AEC兼亮氨酸缺陷型菌株。
②选育抗亮氨酸结构类似物的突变株,从遗传上解除亮氨酸对DAP合成酶的阻遏。 ③选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株,这是一种寻找亮氨酸渗漏缺陷型菌株的有效方法。
5)增加前体物的生物合成和阻塞产物的生成:
方法:
①选育丙氨酸缺陷型;
②选育抗天冬氨酸结构类似物突变株;
③选育适宜的活性比突变株;
6)改变细胞膜的透过性
7)选育温度敏感突变株
8)应用细胞工程和遗传工程育种
9)防止高产菌株回复突变
苏氨酸:在谷氨酸棒杆菌中,由L-天门冬氨酸为起点产生L-苏氨酸和L-异亮氨酸的生物合成途径,整个途径含有两大节点:即由L-丁氨醛酸合成L-赖氨酸或高丝氨酸,以及由高丝氨酸合成L-蛋氨酸或L-苏氨酸直至L-异亮氨酸.在正常情况下,HD(编码基因hom)的底物亲和性以及转化率是其竞争对手二氢吡啶羧酸合成酶(编码基因dapA)的25倍,因此碳源主要流向苏氨酸-蛋氨酸生物合成途径。但当产生菌细胞内苏氨酸大量积累时,由于HD对L-苏氨酸的变构抑制作用极为敏感,导致丁氨醛酸优先进入赖氨酸生物合成途径。苏氨酸生物合成途径的最后一步是将高丝氨酸磷酸酯转化为L-苏氨酸,该反应由苏氨酸合成酶(TS)催化。根据上述苏氨酸生物合成的反应机理,构建高产苏氨酸工程菌的途径操作程序如下:(1)提高野生型hom基因编码产物HD的表达水平,缓和由于苏氨酸变构抑制作用而导致的酶活降低程度,或者直接用homdr突变基因代替生产菌中的野生型hom基因,由此构建出的谷氨酸棒杆菌工程菌可使L-苏氨酸的积累提高至10g/L的水平。(2)在homdr出突变株中,同时克隆表达thrB和thrC基因,但转化子在苏氨酸的合成能力上并没有新的突破。(3)克隆表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因,转化子的L-苏氨酸产率提高了12%。该酶催化反应的产物为草酰乙酸,它是L-天冬氨酸生物合成的前体,因此草酰乙酸的大量积累有助于L-天冬氨酸类氨基酸合成产率的提高。然而,解除苏氨酸对HD的变构抑制只能有限地提高苏氨酸的产率,苏氨酸和赖氨酸的总量不但没有改变,反而有所下降。另一方面,通过过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因也不能有效提高苏氨酸和赖氨酸的合成总量,这说明从L-天冬氨酸至丁氨醛酸的合成途径仍是一个重要的限制因素。事实上,L-苏氨酸的积累还能强烈抑制天冬氨酸磷酸激酶的活性,因此强化表达抗苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸磷酸激酶是高产苏氨酸工程菌构建的又一个重要途径。(4)苏氨酸合成的显著流分被转化成异亮氨酸或者进一步降解为甘氨酸。
赖氨酸:天冬氨酸在合成丁氨醛酸之后开始分叉,一支通向苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的生物合成,另一支则由丁氨醛酸合成L-2,3-二氢吡啶二羧酸,从而进入L-赖氨酸的特异性生物合成途径。二氢吡啶二羧酸在二氢吡啶二羧酸还原酶的催化下合成六氢吡啶二羧酸,由此原核细菌可经3条路线最终合成L-赖氨酸.高产赖氨酸工程菌的构建原理:首先筛选谷氨酸棒杆菌对S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC,一种赖氨酸的结构类似物)显示高抗性的突变株。AEC抗性菌株解除了对天冬氨酸激酶的调控,不为赖氨酸所反馈抑制,因而能在培养基中积累大量的赖氨酸。再往后的努力集中在将主要碳源代谢流由呼吸途径转入到回补途径。为了达到此目的,先分离一株柠檬酸合成酶降低的突变株,并发现它能改善赖氨酸的产量,尤其是与前面提到的HD缺陷和AEC抗性两种突变结合在一起。这一计划后来又派生出很多分支,如氟丙酮酸敏感型突变株(即丙酮酸脱氢酶衰减)、丙氨酸营养缺陷株以及其他类型的突变株。
九.氨基酸生物合成的代谢流量分析涉及到哪几方面的内容?
除了代谢途径及其调节机制和已知途径的化学计量分析以外,稳态代谢流量和流量动力学分析对于理解氨基酸生产的代谢网络也越来越重要,这既涉及到提供碳架物质、 氧化
还原当量和代谢能的中心代谢途径,也涉及到那些通往特定氨基酸的合成代谢途径。
对所有的相关途径进行详细的代谢流量分析。这涉及到底物进入细胞的碳架物流量,流经向心途径、中心代谢途径和离心途径的碳架物流量,以及代谢中间产物流出细胞的碳架物流量 ( the central and peripheral carbon fluxes)。 还原力的流量 ( redox flux )及能量流量(energy flux)。
十.由于我国人多地少,在不争或少争口粮前提下,如何建成1-2个绿色大庆?
生物质产业概念 ,是指利用可再生或循环的有机物质 ,包括农作物 、树木和其它植物及其残体 、畜禽粪便、有机废弃物 ,以及利用边际性土地和水面种植能源植物为原料 ,通过工业 性 加 工 转 化 ,进 行 生 物 基 产 品、生物燃料和生物能源 生产的一种新兴产业。
通过利用低劣生物质资源生产生物燃气。像城市生活垃圾、生活污水、养殖业畜禽粪便这些生物质资源,量大、面广、能量密度低,不易加以利用。但其直接排放会严重污染水源,影响环境。如果开发高效生物转化技术,经发酵生产生物燃气,不仅不会与人争粮、与粮争地,而且缓解能源短缺压力,同时获得可观的绿色能源,极大地减少排放,产生巨大的经济效益。
目前,我国利用以陈化粮、高粱、甘蔗、甘薯生产燃料酒精的技术已经基本成熟。我国生物柴油生产工艺也已取得重大突破,生产成本明显下降,有望在近期实现产业化。在当前石油价格高位运行、我国石油资源短缺的形势下,发展生物质能已经是一个战略的选择。
发展生物质能,有效利用部分生物质能,至少能够形成一个“绿色大庆”。