水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法 精品

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (1): 67–73, www.chinbullbotany.com doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00067 ·技术方法·

水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法

丁承强, 马丹, 王绍华, 丁艳锋*

南京农业大学农学院, 南京 210095

摘要 双向电泳是分析蛋白质混合物的一种有力手段, 已在蛋白质组研究中得到广泛应用。水稻(Oryza sativa) 作为重要的 粮食作物, 对其蛋白质组学研究开展较早。但由于技术复杂, 对实验操作要求高, 初学的研究者很难在较短的时间内掌握该 实验技术。该文介绍了水稻研究中适合多个组织的双向电泳实验方法和优化流程。该优化流程能使新的研究者逐步优化实 验条件, 更快更好地完成双向电泳实验。同时详细介绍了实验关键环节的操作方法。 关键词 蛋白质组学, 水稻, 双向电泳

丁承强, 马丹, 王绍华, 丁艳锋 (2011). 水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法. 植物学报 46, 67–73.

双向电泳作为蛋白质组研究的3大核心技术之一 (另2种是质谱技术和蛋白质组信息学), 是由O’Farrel 于1975年建立的, 并成功分离到约1 000个大肠杆菌 蛋白质。这项技术利用蛋白质的2种特性, 分2步将蛋 白质混合物进行分离。第1步为等电聚焦(isoelectric focusing, IEF), 即根据蛋白质等电点(pI)的差异将蛋 白质分离开。第2步为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝 胶电泳(SDS-PAGE), 即根据蛋白质相对分子量(Mr) 的差异将蛋白质进行分离。理论上, 不同的蛋白质可 以通过这2步分离以单个蛋白质斑点呈现在凝胶图谱 上。

在最初的双向电泳技术中, 由于第1向使用的是 含有载体两性电解质的聚丙烯酰胺管胶, 双向电泳的 分辨率和可重复性较低。后来Gorg 开发出新的双向电 泳技术, 即用固相pH 梯度代替载体两性电解质产生 的pH 梯度, 并用一面带有支持膜的凝胶代替管状凝 胶进行第1向蛋白质分离。此后这一技术得到广泛的 应用。目前利用双向电泳技术, 在水稻(Oryza sativa ) 中的研究很多, 范围也非常广泛, 涉及水分(Ali and Komatsu, 2006) 、温度(Lin et al., 2005; Hashimoto and Komatsu, 2007)、盐胁迫(Yan et al., 2005)、CO 2 (Bokhari et al., 2007)、激素(He and Li, 2008)、重金 属 (Yang et al., 2007b) 、生 长发 育 (Yang et al., 2007a) 、虫害(Wei et al., 2009) 、病害(Kim et al.,

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2004) 、有机物(Ge et al., 2008) 和农药(Lin et al., 2008) 等。

然而, 由于双向电泳实验环节较多, 处理方法各 异, 使初学者难以掌握。在已经发表的介绍实验方法 的文献中, 主要进行了各实验条件的比较(丁坤善等, 2005; 付忠军等, 2009; 王清等, 2009), 只有经验丰富的研究人员才能从中得到进一步优化实验的信息。而没有研究经验的人员在进行实验方法的摸索时, 往往不知道应该先进行哪种条件的优化。在面对不理想的胶图时, 也无法确定是由哪些条件的处理不当引起的, 往往无序地进行实验条件的摸索, 造成时间和金钱的大量浪费。另外在国内还未见有文献介绍水稻中双向电泳的实验方法。由于水稻组织具有一定的特异性, 即使在已经发表的论文中, 双向电泳图谱的质量仍然不高。存在的主要问题有 : 竖条纹 严重(Sengupta and Majumder, 2009) 、染色较深(Lee et al., 2007)以及分离胶浓度不合理(Jagadish et al., 行系统的分析介绍。

2010) 等。因此有必要对水稻的双向电泳分离技术进

本文介绍了一套双向电泳实验优化流程, 并利用

这一优化流程进行了水稻茎和幼穗的蛋白质分离, 证

明这一流程在水稻各个组织的双向电泳中具有普适 些问题往往是初学者经常遇到的, 很容易导致实验结

性。此外, 本文还介绍了大量实验中的细节问题, 这

收稿日期: 2010-09-20; 接受日期: 2010-11-09

基金项目: 国家自然科学基金(No.30471016)和国家科技支撑计划(No.2006BAD02AB-3-2) * 通讯作者。E-mail: [email protected]

果不理想。我们力图使更多的初学者能尽快掌握这一 实验技术, 以期有力推广水稻蛋白质组的研究工作。

所用试剂均为国产分析纯试剂。

以上所有试剂均为分析纯, 所有溶液均使用超纯 水配制。

1 材料与方法

1.1 材料

扬稻6号(Oryza sativa L. ssp. indica ) 在Yoshida 水培 液(Yoshida et al., 1976) 中培养2个月后, 切取整个根 部组织, 立即放入液氮中冷冻, 并保存在–80°C 。成 熟期的茎、幼穗组织取自盆栽培养的水稻。

1.3 双向电泳

1.3.1 蛋白质提取

液氮预冷研钵, 称量1.5 g 水稻根部组织, 冷研钵中将样品反复加液氮研磨至粉末状。将样品转移到50 mL 离心管中, 加入10倍体积(相对于样品) 的10%(w/v)

–1 –1

TCA-丙酮(含1 mmol·L PMSF, 10 mmol·L DTT) 悬浮, 超声处理5分钟, 于–20°C 下静置过夜后, 4°C 、 1.2 试剂配制

蛋白质抽提液: 7 mol·L –1

尿素(GE), 2 mol·L –1

硫脲 (GE), 4%(w/v)CHAPS(Sigma), 0.5%(v/v)两性电解

质(pH3.5–9.5, GE), 1 mmol·L –1

PMSF(Amresco), 10

mmol·L –1

DTT (Amresco)。分装后于–20°C 保存。

考马斯亮蓝G-250 原液 : 100 mg 考马斯亮蓝 G-250(Amresco)溶于50 mL 95%乙醇, 加入100 mL 85%(w/v)磷酸; 考马斯亮蓝工作液(使用前配制): 将 原液与双蒸水按15:85(v/v)混匀, 过滤。

2 μg·L–1

牛血清白蛋白(BSA, Sigma) 溶液储液, 配制后于室温稳定2小时。分装后在–20°C 可保存6–8 个月, –80°C 下保存1年。

胶条平衡缓冲液储液: 6 mol·L –1

尿素, 2%(w/v) SDS(Sigma), 0.38 mol·L –1 Tris-HCl(pH8.8)(Amresco), 20%(v/v) 甘油(Amresco), 分装后于–20°C 保存; 胶 条平衡液A: 使用前每10 mL储液中加入0.1 g DTT; 胶条平衡液B: 使用前每10 mL 储液中加入0.2 g 碘乙 酰胺(BIO-RAD)。

琼脂糖封胶 液 : 0.5% 琼脂糖 (Amresco), 25 mmol·L –1Tris, 192 mmol·L –1

甘氨酸(Amresco), 0.1% (w/v) SDS, 0.001%溴酚蓝(Amresco)。

电泳缓冲液: 25 mmol·L –1 Tris, 192 mmol·L –1

甘 氨酸, 0.1%(w/v) SDS。

固定液: 200 mL 乙醇, 50 mL 冰醋酸, 定容到500 mL; 敏化液: 150 mL乙醇, 34 g 乙酸钠, 1 g 硫代硫酸 钠, 定容到500 mL; 银染液: 1.25 g AgNO3, 200 μL 37%甲醛(使用前加入), 定容到500 mL; 显色液: 25 g Na 2CO 3, 400 μL 37%甲醛(使用前加入), 定容到1 L; 终止液: 10 g甘氨酸, 定容到500 mL。银染步骤中

20 000 ×g 离心15分钟, 弃上清。用10倍体积(相对于

样品 ) 的丙酮 ( 含 1 mmol·L –1 PMSF, 10 mmol·L –1

DTT) 重悬沉淀, –20°C 下静置1小时后, 4°C 、20 000 ×g 离心15分钟, 弃上清。用10倍体积(相对于样品) 的乙醇/乙醚(1:1)混合液重悬沉淀, 于–20°C 下静置过夜后, 4°C 、20 000 ×g 离心15分钟, 弃上清。再次用丙酮溶液重悬沉淀1次后, 离心取出沉淀真空干燥约 5分钟(避免干燥过度) 。另一种处理方法是在TCA-丙 酮沉淀后, 使用80%丙酮沉淀蛋白质(重复3次) 。

得到干粉后, 每20 mg干粉末加入200 μL 蛋白质 抽提液, 超声处理5 分钟, 20°C 下充分溶解1 小时, 20°C 、35 000 ×g 离心15分钟。取上清重复离心1次, 所得上清即为提取的蛋白质溶液。采用Bradford 法进行蛋白质定量。

1.3.2 等电聚焦

本实验分别采用pH3–10NL 、pH4–7和pH5–8 17 cm IPG 胶条进行等电聚焦。上样体积为300 μL, 按照上样量的大小计算所需样品体积、上样缓冲液体积及两性电解质体积(pH3–10NL) 。混匀后于35 000 × g 离心

15分钟。取上清液300 μL 加入聚焦盘中, 将IPG 胶条胶面朝下放入槽内, 使上样缓冲液均匀分布在槽内,

并确保无气泡后, 加入1.5 mL 矿物油, 加盖。放入等电聚焦仪(Bio-Rad)中, 温度控制在20°C, 被动水化6

小时, 主动水化(50 V)6小时。水化结束后立即开始等 电聚焦, 推荐程序见表1。

1.3.3 胶条平衡

完成等电聚焦程序的步骤4后, 用超纯水冲洗胶条5

丁承强等: 水稻蛋白质组双向电泳优化流程及方法 69

表1 等电聚焦程序(每个胶条限流50 μA, 20°C)

Table 1 The program of isoelectric focusing (limit to 50 μA per strip, 20°C)

Time (hours/ Step Voltage ramping Voltage

method (V) voltage×hours)

表2 SDS-PAGE 分离胶配方

Table 2 The volume of each component in the separating gel of SDS-PAGE

Component Volume (mL)

10% sepa-

12% sepa- 1 Rapid 200 1 h 2 Rapid 1 000 1 h

3 Linear 8 000 2 h 4 Rapid 8 000 60 000 V × h

5

Rapid 500 5 h

秒, 然后放入加有6 mL 胶条平衡液A 的水化盘中平衡 15分钟。立即冲洗5秒, 放入6 mL 平衡液B 中再平衡 15分钟。

1.3.4 SDS-PAGE

配制凝胶的各成分比例参照表2, 聚合2小时以上。室内温度低于20°C 时, 可增加过硫酸铵(ammonium persulfate) 的量(最多30%), 以加快聚合。而当室内温度高于30°C 时, 减少30%的过硫酸铵, 可减缓聚合, 提高凝胶质量, 但同时要避免凝胶聚合时间过长。

凝胶聚合后, 用电泳缓冲液冲洗凝胶上端。将平衡好的胶条放在凝胶上端, 并排除气泡。倒掉多余的电泳缓冲液, 加琼脂糖封胶液封住胶条, 即将凝固时, 加入含标准蛋白质的滤纸片。将凝胶放入电泳槽(Bio-Rad PROTEAN PLUS Dodeca cell), 第1步在 50 V 下电泳40分钟, 第2步在200 V 下电泳至结束(溴酚蓝迁移至底边) 。

1.4 银染

将凝胶从玻璃板中取出, 放入瓷盘中进行染色。按以下步骤进行: 固定处理30分钟; 敏化30分钟; 水洗10 分钟, 重复3次; 银染20分钟(遮光); 水洗1分钟(重复 2次); 显色30秒, 倒掉显色液, 加入新的显色液, 直 到染色点清晰可见; 终止处理2小时。

2 结果与讨论

2.1 优化流程及适用性

通过大量的实验, 摸索总结出一套行之有效的用于水稻组织的双向电泳实验优化流程。图1为使用该流程进行优化后水稻根(A)、茎(B)和幼穗(C)中蛋白质的双

rating gel

rating gel

30% acrylamide, 0.8%

16.7 20 N,N’-methylenebis acrylamide 1.5 mol·L –1 Tris (pH8.8) 12.5 12.5 10% SDS

0.5 0.5 10% ammonium persulfate 0.5 0.5 TEMED

0.02 0.02 Ultrapure water

19.8 16.5 Final volume

50

50

向电泳分离图。从图1可以看出, 该优化流程是有效 的。蛋白质点在整个胶图中分布均匀, 数量多且圆, 没有明显的拖尾及横向条纹, 且胶图背景干净。 当

进行水稻蛋白质双向电泳实验时, 按照4步优 化方法能够在很短的时间内获得很好的实验结果。4 步法优化流程为: 蛋白提取方法、第2向分离胶凝胶浓度、上样量和聚焦程序。

2.2 蛋白质提取方法的优化

蛋白质的提取是双向电泳的第1步, 也是最为关键的一步。图2A 显示了利用Tris-HCl 缓冲液提取蛋白质, 经过TCA-丙酮沉淀及3次丙酮清洗后的电泳结果。图 2B 为利用TCA-丙酮法提取蛋白质的电泳结果。通过比较图2A 和B 可以看出, 不同的蛋白质提取方法对双向电泳的分离效果影响巨大。根据不同的研究目的, 应选择不同的蛋白质提取方法。如果需要研究组织中尽可能多的蛋白质, 可以选择TCA-丙酮法。这一方法是目前应用最广的蛋白质提取方法。而当研究目的是可溶性蛋白质时, 可以使用Tris-HCl 缓冲液进行提取。如果研究不同的亚细胞器, 则最常使用梯度离心的方法, 分别提取不同亚细胞器的蛋白质。

大部分研究都需要尽可能多地分离蛋白质。按照这一目的, 我们对TCA-丙酮法进行了调整。根据我们的实验结果, 在水稻中利用乙醇/乙醚(按照1:1的比例混合) 清洗沉淀的效果更好。具体实验流程可以参考“材料与方法”中的蛋白质提取部分。如果提取的组 织中含有大量的糖类, 可以增加乙醇/乙醚的清洗次

图1 水稻不同组织蛋白质的双向电泳凝胶图 (A) 根; (B) 茎; (C) 幼穗

Figure 1 2-D electrophoresis maps of proteins in different tissues of rice

(A) Root; (B) Stem; (C) Young panicle

数。这种方法得到的双向电泳图, 背景比用丙酮清洗 的更加干净。

2.3 SDS-PAGE 凝胶浓度的优化

第2向凝胶浓度对蛋白质的分离效果影响很大。这就 需要确定一个较适宜的分离胶浓度。不同物种的最佳 分离胶浓度 不同 , 如大豆 (Glycine max ) 、棉花 (Gossypium spp.), 较为适宜的分离胶浓度为12%; 但是在水稻中, 采用10%的分离胶浓度效果更好。从 图2可以看出两者的差异明显。图2B 显示, 采用12% 的分离胶浓度, 大部分蛋白质集中于胶图的中部和上 部。通过将分离胶浓度减小, 可以显著拉大蛋白质点 的间距。如图2C 所示, 采用10%的分离胶浓度, 蛋白 质点分布更加均匀, 这样在调整好上样量后能够分离 到更多的蛋白质。

在研究过程中, 还应根据研究目标蛋白质的不 同, 对分离胶的浓度进行适当调整。如NB-LRR 是一 类参与植物抗病的蛋白质。这类蛋白质分子量较大, 通常大于100 kDa 。因此当研究植物的抗病反应时,

pH3–10 的 IPG 胶条 , 上样 量往往在 100–200 μg; pH5–8或pH4–7的胶条, 上样量一般在200–300 μg 。 在完成蛋白质提取方法和凝胶浓度的优化后就 可以进行上样量的优化。这步优化是极为重要的。很 多研究者并不重视该步骤, 认为上样量只要差别不大 对结果影响很小。其实不然。图3A –D 显示, 上样量依 次递减20 μg, 分离结果相差很大。上样量增大, 分离 的蛋白质点数减少(图3A); 上样量减小, 胶图背景变 深(图3D) 。综合比较各个上样量的分离效果, 选择蛋 白质点数多且背景较好的上样量进行双向电泳实验。 就此实验来说, 图3C 中蛋白质点数较多且背景在可 接受的范围内, 但是蛋白质点横纹较多, 所以还需要 进行聚焦程序的优化。

2.5 聚焦时间的优化

为了尽可能多地分离这类蛋白质, 就应适当减小分离 胶的浓度。

2.4 上样量的优化

对上样量影响最大的因素有2个: 一是染色方法, 如 果采用银染, 那么上样量通常在100–300 μg; 二是 IPG 胶条, IPG 胶条的pH 值范围越大, 上样量越少。

通过电泳图可以很容易地判断聚焦时间是不够还是 太长, 只要适当调整就能较快地确定合适的聚焦伏小 时数。如图3C 和D 所示, 蛋白质点的右侧有明显拖尾 而左侧没有, 这是由于聚焦伏小时数过多, 聚焦过度 引起的, 应减少聚焦时间。图4A 中蛋白质点的两侧均 有明显的拖尾, 这是由于聚焦伏小时数过少, 没有完 全聚焦引起的, 应增加聚焦时间。

通过最后的聚焦程序优化, 就可以很好地分离水 稻组织蛋白质(图1A –C) 。但是双向电泳操作步骤繁 多, 很多环节细节处理的好坏往往决定了最终实验的 成败。在讨论中将对决定分离效果的关键环节进行