淀粉液化及糖化实验
淀粉液化及糖化实验
一、实验目的
1. 掌握用酶解法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法； 2. 掌握还原糖的测定方法。
二、实验原理
在发酵过程中，因有些微生物不能直接利用淀粉，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程成为淀粉的糖化，所制得的糖液成为淀粉水解糖。水解淀粉为葡萄糖的方法包括酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室常采用酶解法制备淀粉水解糖。
酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法葡萄糖可分为两步：第一步是利用α-淀粉酶将淀粉转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，这个过程在生产上成为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故该方法也称为双酶法。 1. 酶解法液化原理
淀粉的酶解法液化是以α-淀粉酶作为催化剂，该酶作用于淀粉的α-1,4-糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以α-淀粉酶也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，其碘色反应发生以下变化：蓝色→紫色→红色→浅红色→不显色（即显碘原色）。
酶解法液化因生产工艺不同分为间歇法、半连续法和连续法；液化设备分为管式、罐式和喷射式；加酶方法包括一次加酶法、二次加酶法和三次加酶法；根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法及中温酶和高温酶混合法。本实验采用：高温酶法，间歇式，罐式，一次加酶法。
2. 酶解法糖化原理
淀粉的酶解法糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位依次分解淀粉的α-1,4-糖苷键或α-1,6-糖苷键，由于是从链的一端逐渐一个个地切断为葡萄糖，所以糖化酶也成为外切淀粉酶。 淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中有水的参与反应，故糖化的理论收率为111.1%
(C6H 10O 5) n +H2O →n C6H 12O 6
三、实验仪器与试剂
1. 仪器
分光光度计、恒温水浴锅、烘箱、滴定管、酸度计、电炉、离心机、白瓷板、烧杯、试管等。
2. 试剂
玉米淀粉、α-淀粉酶、糖化酶、PH 试纸、盐酸、葡萄糖溶液、DNS 试剂、无水酒精等。 磷酸-柠檬酸缓冲液（PH6.0）：称取磷酸氢二钠（Na 2HPO 4·12H 2O ）45.23 g ，柠檬酸（C 6H 8O 7·H 2O ）8.07 g ，用蒸馏水溶解定容至1000 mL ，配好后应以酸度计调整PH 值为6.0。
原碘液（存储液）：称取0.5 g碘和5.0 g碘化钾，研磨，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100 mL，储存于棕色瓶中备用。 稀碘液（工作液）：取1 m/L原碘液用蒸馏水稀释100倍（当天制备）。 反应终止液：0.1 mol/L硫酸。
四、实验方法
1. 淀粉的液化
配置30%的淀粉乳（按照0.1 L 配制）两份，调节PH 值至6.5，加入氯化钙（固形物0.2%，钙离子的存在可以保持α-淀粉酶在水解过程中保持活力和稳定性），加入α-淀粉酶（12~20 U/g淀粉）；在剧烈搅拌下，先加热至72 ℃，保温15 min；再加热至90 ℃，并维持30 min，中间不停止搅拌，以达到所需的液化程度（DE 值15~18%）；取小样检测碘色反应呈棕红色；液化反应后，再升温至100~120 ℃，保持5~8 min，以凝聚蛋白质；以6000 r/min离心5 min得到上清液。
2. 淀粉的糖化
迅速将上述上清液用盐酸将PH 调至4.2~4.5，同时迅速降温至60 ℃；然后加入糖化酶（酶活力为10000 U的酶液0.5 mL），于60 ℃保温1~2 h；当用无水酒精检验无糊精存在时，将溶液PH 值调至4.8~5.0，同时，将溶液加热至80 ℃，保温20 min；然后将溶液温度降至60~70 ℃，以6000 r/min 离心5 min 即得到糖上清液；量取该糖液体积，取样分析还原糖含量(测定方法参见附录“葡萄糖含量的测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）”相关内容) 。
五、实验结果
1. 在详细记录实验数据基础上完成下表，计算淀粉转化率。
③ 葡萄糖含量计算
六、实验思考
1. 分析糖化酶用量对糖化效果的影响？ 2. 淀粉液化过程中几个保温过程有何作用？
附录1：葡萄糖含量的测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）
一、实验原理
本实验是利用3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的含量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，故可用于比色测定。葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸试剂反应生成的有色物质在540 nm 波长下有最大吸收峰，故在此波长下进行比色测定。
二、实验方法
1. 标准曲线的绘制
取6支大试管，分别编号0~5，按下表1加入各种试剂。
表1 葡萄糖含量的测定
将各试管中溶液振荡均匀后，在沸水浴中准确煮沸5 min，将试管取出迅速用冷水冷却至室温，加入蒸馏水15 mL，摇匀。在540 nm波长下，用0号试管作为空白调零，测定其他试管内溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品的测定
将发酵液5 mL，以5000 r/min离心5 min，取上清液1 mL置于试管中，加入DNS 试剂3mL ，振荡混匀后，在沸水浴中准确煮沸5 min，取出迅速用冷水冷却至室温，加入蒸馏水15 mL ，摇匀。在540 nm 波长下，用0号试管作为空白调零，测定其他试管内溶液的吸光度。利用Origin 或Excel 软件绘制的标准曲线，求出样品中葡萄糖的含量。