萌发小麦种子淀粉酶酶学性质研究
萌发小麦种子淀粉酶酶学性质研究
陈晓蒙
(东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030)
摘要:本研究以萌发的小麦种子为材料,提取得到淀粉酶液。利用分光光度计法测定淀粉酶分解淀粉所得还原糖与3,5-二硝基水杨酸的还原产物的吸光值,从而得出酶活标准曲线。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶对温度的差异,采用加热的方法钝化β-淀粉酶,测定出α-淀粉酶的活性。在非钝化条件下测定淀粉酶的总活力。将小麦分为种子、芽和整个小麦分别来测定。研究影响淀粉酶活性的因素,在不同温度、不同pH 值、激活剂和抑制剂的条件下由酶反应混合物遇碘呈现的颜色判断出酶活性的的最适温度为40℃,最适pH 值为5.6,NaCl 为激活剂,CuSO4为抑制剂。通过研究淀粉酶的性质使我们更充分地了解,并利用于工业生产、食品加工、医疗等产业。
关键词:淀粉酶 活力 温度 PH 激活剂和抑制剂
The enzymatic properties of amylase in Wheat Seed Germination
Xiaomeng Chen
Northeast Agricultural University Biological Sciences1301 Zip .Code:150030 引言:酶是一种具有催化活性的蛋白质,由氨基酸通过肽链连接而成,只有在适当的温度pH 和离子强度下才具有生物活性。而且生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的,酶既能催化各种生化反应,还能调节和控制代谢的速度、方向和途径,是新陈代谢的调节元件。淀粉酶广泛分布在植物和动物体内,特别是萌发谷物种子。它具有水解淀粉的能力,对生物有很大的影响作用。而淀粉是植物最主要的储藏多糖,也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。因此研究淀粉酶有重要的意义。现代酶学正向着两个方向发展:酶的分子生物学和酶工程学,它们是现代生物技术的重要组成部分,应用范围包括药学、食品、化学工业、诊断分析和生物传感器,涉及的品种不少,
如淀粉酶,其市场需要生产规模和产业均很乐观,并已产生巨大经济效益。
1材料与方法
1.1材料 萌发的小麦种子(芽长约1cm )
1.2 方法
1.2.1 麦芽糖标准曲线的制作
取7支干净的具塞刻度试管,编号,1-7号试管加入麦芽糖标准溶液分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml ,再分别加入蒸馏水2.0、1.8、1.4、1.0、0.6、0.2、0ml ,使得1-7号试管中麦芽糖含量分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8和2.0mg 。再分别加入10g ·L-13,5-二硝基水杨酸2.0ml ,将各试管置于沸水浴中加热5min ,取出后冷却至室温,用蒸馏水定容至20ml 。用1号试管做对照组,空白调零,在520nm 下,分别测定2-7号试管的吸光值A 。以麦芽糖含量(mg )为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
1.3.1淀粉酶活力的制备与测定
称取1g 萌发的小麦种子不同部位,置于研钵中,加少量石英砂和2ml 蒸馏水,研磨匀浆,用6ml 蒸馏水粉刺将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15—20min , 每隔数分钟搅拌一次,使其充分提取。然后在4000 r/min转速下离心10min ,将上清液倒入250ml 容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液,用于淀粉酶活性的测定。吸取上述酶原液1ml ,放入25ml 容量瓶
中,定容摇匀,即得到淀粉稀释液。
1.3.2α-淀粉酶活力的测定:
取3支干净试管,编号,1号加入1.0ml 淀粉酶原液,置于70摄氏度水浴15min ,冷却,将各个试管和淀粉溶液置于40摄氏度恒温水浴中保温10min ,加入PH5.6的缓冲溶液1.0ml ,0.4MNaOH 溶液4.0ml ,1%淀粉溶液2.0ml ,在40摄氏度恒温水浴中准确保温5min ,保温过后加入0.4MNaOH 溶液0.0ml ;2号加入1.0ml 淀粉酶原液,置于70摄氏度水浴15min ,冷却,将各个试管和淀粉溶液置于40摄氏度恒温水浴中保温10min ,加入PH5.6的缓冲溶液1.0ml ,0.4MNaOH 溶液0.0ml ,1%淀粉溶液2.0ml ,在40摄氏度恒温水浴中准确保温5min ,保温过后加入0.4MNaOH 溶液4.0ml ;3号加入1.0ml 淀粉酶原液,置于70摄氏度水浴15min ,冷却,将各个试管和淀粉溶液置于40摄氏度恒温水浴中保温10min ,加入PH5.6的缓冲溶液1.0ml ,0.4MNaOH 溶液0.0ml ,1%淀粉溶液2.0ml ,在40摄氏度恒温水浴中准确保温5min ,保温过后加入0.4MNaOH 溶液4.0ml 。
1.3.3总酶活力的测定:
取3支干净试管,编号,1号加入1.0ml 酶稀释液,将各个试管和淀粉溶液置于40摄氏度恒温水浴中保温10min ,加入PH5.6的缓冲溶液1.0ml ,0.4MNaOH 溶液4.0ml ,1%淀粉溶液2.0ml ,在40摄氏度恒温水浴中准确保温5min ,保温过后加入0.4MNaOH 溶液0.0ml ;2号加入1.0ml 酶稀释液,将各个试管和淀粉溶液置于40摄氏度恒温水浴中保温10min ,加入PH5.6的缓冲溶液1.0ml ,0.4MNaOH 溶液0.0ml ,1%淀粉溶液2.0ml ,在40摄氏度恒温水浴中准确保温5min ,保温过后加入0.4MNaOH 溶液4.0ml ;2号加入1.0ml 酶稀释液,将各个试管和淀粉溶液置于40摄氏度恒温水浴中保温10min ,加入PH5.6的缓冲溶液1.0ml ,0.4MNaOH 溶液0.0ml ,1%淀粉溶液2.0ml ,在40摄氏度恒温水浴中准确保温5min ,保温过后加入0.4MNaOH 溶液4.0ml 。
将各试管摇匀,分别取2ml 放入25ml 刻度管中,再加入2mlDNS 试剂混匀沸水浴 煮沸5min 取出冷却,再用蒸馏水稀释至25ml 混匀,在分光光度计上540nm 处进行比色,测定光密度值,记录测定结果。
1.4.1淀粉酶粗酶液的提取
称取0.5克萌发小麦种子,研磨后放置5min ,在4000r/min的条件下离心,10min 后取上清液于25ml 容量瓶并定容至刻度线。
1.4.2温度对淀粉酶活性的影响
取6支试管,分别标记A ,a ,B ,b ,C ,c ,D ,d ,A 号管中加入PH5.6的缓冲液1.0ml ,淀粉溶液2.5ml ,保温于4摄氏度环境中,将a 管中加入1.0ml 淀粉酶提取液,然后将A 中混合液倒入a 中,在4摄氏度条件下进行酶促反应10min ,取出,冷却至室温,加入碘液1-2滴,观察其颜色;B 号管中加入PH5.6的缓冲液1.0ml ,淀粉溶液2.5ml ,保温于室温环境中,将b 管中加入1.0ml 淀粉酶提取液,然后将B 中混合液倒入b 中,在室温条件下进行酶促反应10min ,取出,冷却至室温,加入碘液1-2滴,观察其颜色。C 号管中加入PH5.6的缓冲液1.0ml ,淀粉溶液2.5ml ,保温于40摄氏度环境中,将c 管中加入1.0ml 淀粉酶提取液,然后将C 中混合液倒入c 中,在40摄氏度条件下进行酶促反应10min ,取出,冷却至室温,加入碘液1-2滴,观察其颜色;D 号管中加入PH5.6的缓冲液1.0ml ,淀粉溶液2.5ml ,保温于沸水浴环境中,将d 管中加入1.0ml 淀粉酶提取液,然后将D 中混合液倒入d 中,在沸水浴条件下进行酶促反应10min ,取出,冷却至室温,加入碘液1-2滴,观察其颜色。
1.4.3 pH对淀粉酶活性的影响
取三支试管,编号,1号试管中加入PH=3.0的Buffer 溶液2.0ml ,淀粉溶液
2.5ml ,酶提取液1.0ml ,混匀,在40摄氏度条件下进行酶促反应10min ,加1滴碘液,观察颜色反应。2号试管中加入PH=5.6的Buffer 溶液2.0ml ,淀粉溶液
2.5ml ,酶提取液1.0ml ,混匀,在40摄氏度条件下进行酶促反应10min ,加1滴碘液,观察颜色反应。3号试管中加入PH=8.0的Buffer 溶液2.0ml ,淀粉溶液
2.5ml ,酶提取液1.0ml ,混匀,在40摄氏度条件下进行酶促反应10min ,加1滴碘液,观察颜色反应。
1.4.4 激活剂或抑制剂对淀粉酶活性的影响
取三支试管,编号,1号管中加入PH5.6的Buffer 溶液2.0,NaCl 溶液1.0ml ,淀粉溶液2.5ml ,酶提取液1.0ml ,混匀,于40摄氏度条件下进行酶促反应10min ,取出,加入碘液1滴观察其颜色;2号管中加入PH5.6的Buffer 溶液2.0,CuSO4溶液1.0ml ,淀粉溶液2.5ml ,酶提取液1.0ml ,混匀,于40摄氏度条件下进行
酶促反应10min ,取出,加入碘液1滴观察其颜色;3号管中加入PH5.6的Buffer 溶液2.0,蒸馏水1.0ml ,淀粉溶液2.5ml ,酶提取液1.0ml ,混匀,于40摄氏度条件下进行酶促反应10min ,取出,加入碘液1滴观察其颜色。
2. 结果与分析
2.1淀粉酶活性
由计算得
2.2温度对淀粉酶活性的影响
1号管:4℃,淀粉几乎未被水解,酶几乎完全失活;
2号管:室温,淀粉被部分水解,酶的活性受到一定的抑制;
3号管:40℃,淀粉几乎完全被水解,酶的活性达到相对最大;
4号管:100℃,淀粉未被水解,酶完全失活。
由图可知,40℃是小麦淀粉酶最适温度。
淀粉酶的最适温度是40℃,温度偏高偏低都会影响酶的活性甚至导致酶的
失活。致使在一定时间内淀粉的水解,如果淀粉失活这淀粉不水解(例如本实验的100℃的试管)。。在一定温度范围内,淀粉酶的活性随温度的升高而增强,当达到某一温度(40℃左右)时,酶的活性达到最大,当超过这一温度后,酶的活性随温度的升高而减弱。
2.3 pH对淀粉酶活性的影响
1号管:pH=3.0 淀粉几乎未被水解,酶几乎完全失活;
2号管:pH=5.6 淀粉几乎完全被水解,酶的活性相对达到最大;
3号管:pH=8.0 淀粉部分被水解,酶的活性受到一定的抑制作用。
由图可知,pH=5.6是淀粉酶的最适pH 值。
PH 值是影响酶活的主要因素,通常各种酶只在一定的PH 范围内才表现出活性,同一种酶在不同的PH 下所表现的活性不同,其活性最高时的PH 称为酶的最适PH 值。PH 影响酶分子构象的稳定性, 影响酶分子极性基团的解离状态, 也影响底物的解离。
2.4激活剂或抑制剂对淀粉酶活性的影响
1号管:加NaCl 溶液,淀粉相对水解完全,酶的活性增加;
2号管:加CuSO4溶液,淀粉部分被水解,酶的活性受到一定的抑制作用; 3号管:加蒸馏水,对照组。
NaCL 中CL 离子为淀粉酶激活剂,CL 离子使淀粉酶活性增强;CuSO4中Cu 离子为淀粉酶抑制剂,Cu 离子使淀粉酶活性减弱。
2. 讨论与结论
影响淀粉酶活性的因素是多方面的。本实验着重研究了温度、pH 、激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响。在实验过程中,温度、pH 值、激活剂和抑制剂是影响酶活性的几个重要因素,只研究其中一个因素对酶活性的影响时,要尽量控制其他因素在最适标准上,从而研究这一单一因素对酶活性的影响。由实验结果可知,在一定温度范围内,低温时酶对淀粉的反应影响较慢,到达最适温度(40℃左右)是反应速率最快,此后随温度升高,酶的活性对反应的影响减慢,高温时酶失活。一种酶的最适温度也不是完全固定的,它与作用时间长短有关,一般作用时间越长则最适温度越低,而作用时间越短则最适温度越高,因此需要严格控制反应时间,准确按照实验步骤进行;在一定pH 范围内,酶在高于或低于最适pH (5.6左右)时都会使酶活性降低,酶的最适pH 也受底物性质的影响,还受缓冲液性质的影响:Cl 离子使淀粉酶活性增强,为淀粉酶激活剂,Cu 离子使淀粉酶活性减弱,为淀粉酶抑制剂。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量都很小,且具有特异性。
通过查阅资料可知,淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一,它有许多的用途,对淀粉酶活性的研究可以使我们准确知道淀粉酶活性,最适温度、pH
值、激活剂和抑制剂种类有助于更好的应用淀粉酶,对我们的生产生活有巨大的利益,例如:面包烘焙烤工业。淀粉酶用于面包工业,可以使产品体积更大,颜色更好,颗粒更柔软。
α—淀粉酶不耐酸,在pH=3.6以下迅速钝化;β—淀粉酶不耐热,在70℃15min 钝化。然而本实验都进行研究,使结论不够明确。其中α—淀粉酶作为一种重要的工业用酶,广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业,因此对其做更深层次的研究具有重要的意义。
通过此次实验研究,进一步加深了对淀粉酶的认识和学习,同时培养了设计实验的技能,学会如何提出合理的实验方案,为以后研究其他种类的酶提供了研究方法和实验依据。
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