应用荧光探针DPH测定完整红细胞膜的流动性
1996年11月第16卷第6期
南京医科大学学报(中文版)
ACTAACADEMIAEMEDICINAENANJING
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应用荧光探针DPH测定完整红细胞膜的流动性
刘 丰
(南京医科大学分子生物学研究所,南京 210029)
摘 要 建立了应用荧光探针1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)测定完整红细胞膜流动性的
方法。通过对DPH与完整红细胞膜结合后的荧光光谱,以及邻苯三酚和超氧化物歧化酶(SOD)对膜脂流动性影响的分析,证明了这一方法的可行性。
关键词 DPH;红细胞;微粘度中图法分类号 R392.11
红细胞膜流动性与其寿命、变形性、膜表面酶活性、受体活性、特异性抗原、能量转换器、氧弥散以及离子通透性等多种功能密切相[1]
关。研究细胞膜流动性是了解膜结构与功能关系的重要环节。在各种研究方法中,由于荧光偏振方法[2]比较简单,理论解释相对容易,其测定参数荧光偏振度能定量说明膜脂分子的运动情况,因而得到广泛应用。由于对1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(1,6-diphenyl-1,3,5,hexatrieneDPH)作荧光探针进行完整细胞膜脂流动性测定存有不同看法[3]。因此,一般都先通过溶血制备红细胞膜——影泡(ghost)后,再进行其流动性的研究。其方法繁锁,操作条件要求高。因在溶血和高速离心过程中,极易造成膜表面含有或吸附的蛋白发生变化,或使细胞膜完全裂解成碎片,从而影响结果的准确性。故本文参照文献[4],用邻苯三酚在碱
-
(0.01mol/L,pH7.4)稀释成2×10-6mol/L的工作液。将洗净的红细胞与2×10mol/LDPH在25℃条件下温育15分钟。红细胞数为6×10～8×10个/ml。1.2 邻苯三酚处理红细胞
用1mol/L邻苯三酚(AR)按不同浓度处理红细胞,37℃温育10分钟后用PBS清洗红细胞3次,再用DPH标记。
1.3 SOD对红细胞膜的保护
预先在红细胞悬液中加入SOD(比活6000U/mg)后,再加入邻苯三酚。以后方法同1.2。
1.4 荧光偏振度测定
RF-540荧光分光光度计,加偏振装置。激发波长362nm,发射波长454nm。按下列公式计算荧光强度I,荧光偏振度P和微粘度-G:
I=IVV+2IVH;
P=IVV-GIVH/IVV+GIVH;-G=2P/0.46-P
式中IVV:起偏和检偏器光轴同为垂直方向时测得的荧光强度;IVH:起偏和检偏器光轴分别为垂直和水平方向时测得的荧光强度。G=IHV/IHH:校正因子。IHV:起偏和检偏器光轴分别为水平和垂直方向时测得的荧光强度;IHH:起偏和检偏器光轴同为水平方向时测得,6
6
-6
性条件下自氧化产生的O2处理未经和经超氧化物歧化酶(SOD)保护的完整红细胞。其结果不仅表明DPH可用于完整红细胞膜流动性的测定,同时还提供了一种简单的研究膜过氧化损伤及保护的实验模型。1 材料与方法
1.1 DPH标记
-3
用四氢呋喃(AR)配2×10mol/L・
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小。反之,则相反。2 结果和讨论
2.1 DPH与完整红细胞膜结合后的荧光光谱(图1)
在PBS中2×10-6mol/LDPH是没有荧光的[5]。当DPH掺入到细胞膜脂的烃链区后,介质粘度变大,顺反异构化受到抑制,从而成为唯一能发荧光的全反构型[2]。结合后的DPH,其最大激发峰位在362nm,最大发射峰位在454nm
。
后测定。
图2 荧光强度与温育时间的关系
2.3 邻苯三酚浓度对完整红细胞膜微粘度的影响和SOD的保护作用(图3)
红细胞膜的微粘度,随邻苯三酚浓度增加而增大。当达1.5mmol/L后,-G值变化相
对稳定。这时-G值增加了40%(P
图1 DPH与完整红细胞膜结合后的激发
和发射光谱
1:DPH与完整红细胞膜结合后的激发(A)和发射(B)光谱;2:完整红细胞悬液的激发(A)与发射(B)光谱;3:2×10-6mol/LDPH的激发(A)与发射(B)光谱
图3 不同浓度邻苯三酚对完整红细胞膜微粘度的
影响以及SOD对红细胞的保护(-x±s,n=5)
1:经邻苯三酚处理的完整红细胞膜微粘度变化;2:加入SOD后的红细胞膜微粘度变化;与邻苯三酚0mmol/L比较,*P
2.2 红细胞与DPH的温育时间(图2) 由图2可见,荧光强度在10分钟后即达平衡。45分钟后开始下降,这可能是DPH自
作用下氧化产生短链产物丙二醛(MDA)。膜脂上的NH2MDA能进入水相和膜蛋白、
交联形成Schiff′s碱而降低膜流动性。而
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-・
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不受O2等一系列自由基的破坏,使得膜流动性未受影响。3 结 论
荧光探针DPH与完整红细胞温育后,在其激发与发射光谱上都出现了明显的激发和发射峰位,说明DPH已与完整红细胞膜结合。红细胞在受到O
-・2
fluidityinthepathogenesisofdisease.NewEn-glJMed,1977,297∶371
2 ShinitzkyM,etal.Fluidityparametersoflipid
regionsdeterminedbyfluorescencepolariza-tion.BiochimBiophysActa.1978,515∶3673 CollardJG,etal.Localizationofthelipid
probe1,6-diphenyl-1,3,5hexatriene(DPH)inintactcellsbyfluorescencemicroscopy.ExpCellRes,1978,116∶447
4 秦德安,等.邻苯三酚对红细胞膜的过氧化损伤
作用,生物化学与生物物理进展.1988,15(2)∶121
5 AloniBetal.Dynamicsoferythrocytelipidsin
intactcells,inghostmembranesandinlipo-somes.BiochimBiophysActa,1974,348∶438
(1995-12-28收稿)
等一系列自由基和
过氧化物作用后,其膜流动性明显降低。而SOD对其有保护作用。说明完整红细胞可以通过测定其膜流动性变化的方法而用于抗衰老、抗氧化等方面的研究。最后需指出,因荧光偏振度随温度变化而异,因此本实验仅是25℃时的结果。
参考文献
1 CooperRA.Abnormalitiesofcell-membrane
FluidityofIntactErythrocytesDeterminedbyFluorescentProbeDPH
LiuFeng
TheInstituteofMedicalMolecularBiology,NanjingMedicalUniversity,
Nanjing210029
Abstract AmethodemployingfluorescentprobeDPHtodetectthemembranefluidityofintacterythrocytewasestablished.ThefeasibilityandreliabilityofthemethodwasprovenbyexaminingthefluorescentspectraafterDPHandmembraneassociation,andbyanalysingtheeffectsofpyrogallolandSODonthefluidityofmembranelipids.
Keywords DPH;intacterythrocyte;microviscosity