细胞中多巴胺及儿茶酚胺异喹啉类物质HPLC-MS_MS检测
全国生物医药色谱学术交流会（２０１０）论文集
Ｃ３６细胞中多巴胺及儿茶酚胺异喹啉类物质ＨＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ
检测
段晋燕郭琳娜张永谦李玉娟邓玉林・
北京理工大学生命学院北京１０００８１
摘要：本文建立了高效液相色谱，质谱法测定细胞样品中多巴胺（Ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ）、１－甲基．６，７．二羟基。ｌ，２，３，４．四氢异喹啉（Ｓａｌｓｏｌｉｎｏｌ，Ｓａｌ）和Ｎ一甲基一６，７．二羟基．１，２，３，４．四氢异喹啉（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ．ｓａｌｓｏｌｉｎｏｌ，Ⅻ池ａ１）含量的检测方法。细胞样品经超声破碎，离心取上清，经１Ｍ高氯酸溶液除蛋白，再次离心取上清后，经高效液相色谱．质谱测定，选择母子．离子对多离子反应监测（ＭＲＭ），内标法进行定量。采用Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＠ＨＳＦ５柱（１５０ｍｍｘ２．１ｍｍ，３ｕＩＩＩ）；流动相为５ｍＭ甲酸铵缓冲溶液（ｐＨ＝３．０）一甲醇（８０：２０，Ｖ～）。ＤＡ、Ｓａｌ和ＮＭＳａｌ在０．５～１００ｐ观范围内线性关系良好（ｒ＞０，９９９５），检出限分别为０．２０，０．３４，０．３３耀肛，日内和日问精密度（以相对标准偏差表示，ＲＳＤ）均低于８％，回收率分别为９１．４％一１０９．６％，８７．４％一１０９．７％，８８。Ｏ％～１０２。７％。用该方法检测经过氧化氢诱导的神经母细胞瘤细胞ＳＨ．ＳＹ５Ｙ，发现ＤＡ和Ｓａｌ的含量与对照组相比都有显著增加。该方法选择性好，灵敏度高，适用于测定细胞样品中ＤＡ、Ｓａｌ和ＮＭＳａｌ的含量的相关研究。
关键词：高效液相色谱串联质谱多反应监测多巴胺儿茶酚胺异喹啉
外源性神经毒如：１．甲基一ｌ，２，３，６．四氢比啶（ＭＰＴＰ），百草枯等儿茶酚胺异喹啉衍生物可能参与了胶质细胞的死亡，是公认的帕金森致病物ｌｌ吲。儿茶酚胺异喹啉类物质ＭＰＴＰ的结构类似物，具有潜在的帕金森氏症致病性卜丌。在来源于人或者鼠的生物样品中都检测到了由多巴胺（Ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ）和乙醛反应生成的１．甲基．６，７．二羟基．１，２，３，４．四氢异喹啉（Ｓａｌｓｏｌｉｎｏｌ，ＳａＤ及其甲基化产物Ｎ一甲基一６，７－二羟基－１，２，３，４．四氢异喹啉（Ｎ．ｍｅｔｈｙｌ．ｓａｌｓｏｌｉｎｏｌ，ＮＭｓａｌ）这两种儿茶酚胺异喹啉类物质【８．９】。因此，定量测定ＤＡ、Ｓａｌ和ＮＭＳａｌ的含量可以为研究儿茶酚胺异喹啉类物质对帕金森氏证的致病性提供研究基础。
生物体内测定ＤＡ含量的方法早已报道，如液相色谱．电化学（ｎＰＬＣ．ＥＣＤ）ｔ１０１，液相色谱．荧光检测方法（ＨＰＬＣ．ＦＬＤ）ｕ１．１２】和液相色谱．串联质谱法（ＨＰＬＣ．ＭＳ／ＭＳ）１１３ｑ５】，但测定Ｓａｌ，ＮＭＳａｌ含量的方法的报道并不多见【ｌ酬。
本实验室以五氟苯基柱为分离柱，使用Ａｇｉｌｅｎｔ１１００系列高效液相色谱仪和６４６０三重四级杆质谱仪，建立了同时检测细胞中ＤＡ，Ｓａｌ和ＮＭＳａｌ含量的方法。该方法通过使用对母子离子对进行监测模式（ＭＲＭ），大大提高了方法的选择性，抗干扰能力强。且样品的保留时阔在５．２￣９．７ｍｉｎ之间，即能保证待测物不与生物样品中的其他杂质共流出，干扰检测结果，同时又能使待测物在Ｂ时间内流出，确保检测的快捷性。实验中测定了正常神经母细胞瘤细胞ＳＨ—ＳＹ５Ｙ与过氧化氢处理过的细胞中上述三种物质的含量，发现在氧化应激的条件下ＤＡ，Ｓａｌ和ＮＭＳａｌ含量的变化，有助于进～步了解帕金森病人脑部纹状体多巴胺能神经元特异性死亡的病理原因。１３１
细胞中多巴胺及儿茶酚胺异喹啉类物质HPLC-MS/MS检测
作者：
作者单位：段晋燕， 郭琳娜， 张永谦， 李玉娟， 邓玉林北京理工大学生命学院 北京 100081
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