家蝇蛆抗菌肽提取工艺研究

昆虫学报Acta Entomologica Sinica , February 2007, 50(2) :106-112ISSN 0454 6296

家蝇蛆抗菌肽提取工艺研究

陆 婕, 钟 雅, 柳 林, 付 康, 陈正望

*

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(华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所, 武汉 430074)

摘要:蝇蛆抗菌肽多有广谱抗菌、抗癌等功能, 是很好的天然抗菌药物来源, 但由于得率较低, 目前对其产品开发的研究较少。以家蝇Musca domestica 干蝇蛆为原料, 利用加热 层析法和海藻酸吸附法2种工艺提取蝇蛆抗菌肽。结果表明:加热 层析法快速、简便, 抗菌肽提取得率达0 26%, 是海藻酸吸附法提取抗菌肽得率的5 2倍。提取的家蝇抗菌肽主要是分子量6 2~17 2kD 、等电点5 59~5 91的弱酸性小分子多肽, 其热稳定性高, 能杀灭枯草杆菌Bacillus subtilis 等多种革兰氏阳性菌。加热 层析法能有效去除外源性蛋白酶, 保证肽类产品的稳定性, 同时还能提取出非蛋白类的抗菌成分, 提示其对开发具有高附加值的抗菌产品将会有良好的应用前景。关键词:家蝇; 抗菌肽; 提取工艺; 资源利用; 抗菌产品

中图分类号:Q514 3 文献标识码:A 文章编号:0454 6296(2007) 02 0106 07

Optimization of extraction technique for antibacterial peptides from Musca

domestica larvae

LU Jie , Z HONG Ya , LI U Lin, FU Kang, CHEN Zheng Wang

*

*

**

(Institute of Biophysical and

Bioche mistry , Colle ge of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Tec hnology, Wuhan 430074, China)

Abstract :It is not good enough to produce antibacterial peptides by genetic engineering because of much technology troubles involved and the mono kind of peptide with narrow antimicrobial spectrum. It is very significant and valuable to isolate antibacterial peptides from abundant crude resource. Antibacterial peptides e xtracted from Musca larvae, which have multi functions such as antibacterial and antitumor activities, are good natural medicine resources, but the product development research is fe w for the lo wer extracting ratio. Using natural material of dried Musca domestica larvae, by c omparing the activities and characteristics of antibacterial peptides extracted by two methods such as heat chromatography and alginic acid absorption, it had been proved that heat chromatography was a quick, simple method with 0 26%peptides e xtracting ratio which was 5 2 fold to that of alginic acid absorption. The major antibacterial peptides extracted by heat chromatography were determined having Mw 6 2-17 2kD with Tricine SDS PAGE and pI 5 59-5 91with I EF P AGE. The peptides were very thermo stable and had antibacterial activity against Gram positive bacteria such as Bacillus subtilis . Besides maintaining the stability of bioactive peptides by re moving the exotic proteases, the heat chromatography could also extract non peptides with antibacterial activity. This technique may be used to exploit the resource of houseflies sufficiently and develop the antibacterial produc ts with high additional value supplying to medical treatment and health protection.

Key words :Musca domestica ; antibacterial peptide; extraction technique; resource utilization; antibacterial product

利用基因工程方法生产抗菌肽除了工艺等问题

外, 还由于抗菌肽种类单一而效果欠佳。从来源丰

基金项目:国家自然科学基金项目(30370647) ; 国家 863 计划项目(2002AA214061)

作者简介:陆婕, 女, 1973年生, 安徽人, 讲师, 博士, 主要从事生物活性肽的分离纯化和性质研究, E mail:lujie. jane@163. com *陆婕和钟雅同为第一作者Equal contributions were made by LU J ie and ZHONG Ya

**通迅作者Author for correspondence, Tel. &Fax:86 27 87792027; E mail:zwchen21@hotmail. com 16; Accepted: 21

2期陆 婕等:家蝇蛆抗菌肽提取工艺研究

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富的天然材料中纯化抗菌肽很有应用前景。家蝇Musca domestica 是我国大部分地区最常见、数量最多的一种蝇类。蝇蛆中存在抗菌肽、几丁糖、凝集素等大量抗菌、抗癌活性物质(贺继东和夏文水, 2002; 曹小红等, 2003; 宫霞等, 2004; 王明福等, 2004; 罗金香等, 2005) , 即使在人工大规模高密度饲养条件下也不会发生集体染病, 是很好的天然抗菌药物来源。提高蝇蛆抗菌肽的提取得率对大规模的生产制备非常重要。研究家蝇抗菌肽的纯化工艺对开发家蝇资源、生产抗菌产品有着重要的意义。国内学者探索了诱导家蝇抗菌肽产生的条件(周永富等, 1997; 王远程等, 1997; 饶军华等, 1999; 安春菊等, 2003, 2004; 赵瑞君等, 2005) 以及各种分离纯化工艺(柏鸣和周立, 2002; 盛长忠等, 2002; 宫霞等, 2003; 刘晖等, 2004; 安春菊等, 2005) , 但与规模化生产还存在一定距离。陆婕等(2006) 根据家蝇抗菌肽主要是偏酸性小肽等性质, 摸索了多种分离条件。现报道一种得率较高且适宜批量生产家蝇抗菌肽的提取工艺。

(2006) 方法, 500g 干蝇蛆用0 5mol L 乙酸溶液(4 5L) 匀浆处理, 4! 提取过夜, 离心、过滤后得到4L 蝇蛆抗菌肽酸提取液。

1 2 2 蝇蛆抗菌肽提取的工艺流程:按图1所示流程将蝇蛆抗菌肽酸提取液以2种工艺进行提取, 具体方法:(1) 加热 层析法:将2L 蝇蛆抗菌肽酸提取液(相当于干蝇蛆原料250g) 置100! 水浴保温50min, 4! 15000r min 离心40min, 收集沉淀, 该热变性蛋白记为沉淀A; 将上清液冻干, 得到干物质B, 按1 2 3节方法进行Sephadex G25coarse 柱脱盐 层析, B 不溶于0 2mol L 乙酸的部分记为沉淀B 0, 根据洗脱曲线收集洗脱峰B 1和B 2; (2) 海藻酸吸附法:将2L 蝇蛆抗菌肽酸提取液(相当于干蝇蛆原料250g) 按陆婕等(2006) 方法用海藻酸吸附提取, 用布氏漏斗抽滤收集吸附了多肽的海藻酸后, 将滤液直接冻干, 得到干物质D; 海藻酸吸附的多肽进一步经洗脱、盐析得到干物质C, 按1 2 3节方法进行Sephadex G50fine 柱凝胶层析, C 不溶于0 2mol L 乙酸的部分记为沉淀C 0, 根据洗脱曲线收集洗脱峰C 1~C 11。

1 2 3 凝胶过滤:用0 2mol L 乙酸充分平衡Sephadex G25coarse 柱(26mm ∀1000mm ) 或Sephadex G50fine 柱(26mm ∀1000mm) , 将样品溶于15mL 0 2mol L 乙酸, 离心, 收集沉淀并冻干; 将上清液上样, 用0 2mol L 乙酸洗脱, 流速2mL min, 280nm 波长监测, 根据洗脱曲线收集洗脱峰, 冻干。1 2 4 抗菌活力检测:各样品按微量液体检测法(陆婕等, 2006) 测定杀菌活性。

1 2 5 蛋白质电泳:分离小肽的Tricine SDS PAGE 蛋白质电泳、等电聚焦电泳(IEF PAGE) , 参照Hermann 和Gebhard(1987) 、汪家政和范明(2002) 以及陆婕等(2006) 方法进行。分离胶浓度为17%, 每孔上样量20 g 。

1 2 6 蛋白质分子量和等电点计算:参照Hermann 和Gebhard(1987) 、汪家政和范明(2002) 以及陆婕等(2006)方法计算。在分子量回归方程Y =a X +b 中, Y 为相应蛋白分子量的对数值(lgMw) , X 为蛋白迁移距离(m m) ; 在等电点回归方程Y =a X +b 中, Y 为蛋白所在胶的pH 值, X 为该蛋白迁移距离(mm) 。回归计算得到相应的a 、b 值后, 将待测蛋白的迁移距离值代入, 即可计算得到该蛋白的分子量或等电点。

1 材料和方法

1 1 材料

供试蝇蛆:家蝇干蝇蛆即市售中药 五谷虫 , 购于湖北省华城医药有限公司。

测试菌株:枯草杆菌Bacillus subtilis 、野生型金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 由华中科技大学微生物实验室提供; 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 由华中农业大学生命科学与技术学院微生物实验室提供。

主要试剂:Sephade x G25coarse 、Sephade x G50fine (Amersham), 丙烯酰胺、双丙烯酰胺、载体两性电解质(pH 3 5~10) (Sigma ) , 海藻酸(瑞典Karolinska 学院赠送) , 标准蛋白分子量(Fermentas) , 家蝇抗菌肽MD 7095(本实验室分离纯化) 。其他试剂均为进口分装分析纯。

主要仪器:层析系统( KTA prime, Amersham, 瑞典) , 微量蛋白质垂直电泳仪(Mini PROTE AN 3Cell, Bio rad, 美国) , 冻干机(SNL 315SV Speed Vac, Savant, 美国) , 高速冷冻离心机(GL21M, 英泰, 长沙) 。

1 2 方法

1 :

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Sephadex G25coarse 柱脱盐, 收集各洗脱峰(图2:a)

2 结果与分析

2 1 层析结果

按照图1所示流程用2种提取工艺提取蝇蛆抗菌物质。

利用加热 层析法收集的B 物质溶于0 2mol L 乙酸后, 得到少量沉淀B 0, 上清液分别分4批上样

并冻干; 组分B 1呈淡黄色, 质地蓬松, 组分B 2为深褐色, 极易吸潮呈粘稠状。利用海藻酸吸附法提取的肽粗品C 组分溶于0 2mol L 乙酸后, 得到少量沉淀C 0, 上清液经Sephadex G50fine 柱层析, 按洗脱曲线收集得到C 1~C 11共11个组分(图2:b) , 未被海藻酸吸附的滤液取少量冻干得到组分D 。各主要组分的质量见图1

中的标注。

图1 蝇蛆抗菌物质的提取工艺流程图

Fig. 1 Scheme of extraction process of antibacterial components from Musca domestica larvae

A:热变性蛋白沉淀Thermal denaturation protein precipitation; B:上清液冻干后的物质Material l yophilized fro m s upernatant; B 0:B 物质不溶于0 2mol L 乙酸的沉淀部分The 0 2mol L HAc i nsoluble material of B; B 1, B 2:B 物质中溶于0 2mol L 乙酸的部分经G25coarse 脱盐柱层析得到的2个组分Two fracti ons chromatographed by G25coars e column from 0 2mol L HAc soluble material of B; D:未被海藻酸吸附的酸提取物冻干后的物质Lyophilized materi al e xtracted by acid but un absorbed by alginic acid; C:海藻酸吸附的多肽洗脱后经盐析得到的干物质Material salted out from the washed peptide absorbed in alginic acid; C 0:C 物质中不溶于0 2mol L 乙酸的沉淀部分The 0 2mol L HAc ins oluble material of C; C 1~C 11:C 物质中溶于0 2mol L 乙酸的部分经G50柱层析得到的11个组分Eleven fractions chromatographed by G50col umn from 0 2mol L HAc s oluble material of C. 下同The same

below.

图2 蝇蛆抗菌肽B 组分的Sephadex G25coarse (a) 和C 组分的Sephadex G50fine(b) 柱层析图

Fig. 2 Chromatograms of fraction B on the gel filtration chromatography on a Sephadex G25coarse colu mn (a)

and fraction C on gel filtration chromatography on a Sephadex G50fine column (b)

2期陆 婕等:家蝇蛆抗菌肽提取工艺研究

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2 2 抗菌活性分布

将各组分的作用终浓度调整为25 g L, 利用微量液体检测法(陆婕等, 2006) 测定各组分对4种供试菌的杀菌效果。结果(表1) 表明:(1) 组分B 1、B 0和C 0对苏云金芽孢杆菌和枯草杆菌有杀菌活性, 说明凝胶柱的洗脱缓冲液可直接采用0 5mol L 乙酸, 以减少活性物质的损失; (2) 热沉淀蛋白A 没有抗菌活性, 可见加热能除去不耐热蛋白, 有利于耐热的抗菌肽的分离提取; (3) 海藻酸吸附后盐析得到的蛋白组分C 经Sephadex G50fine 柱层析分离得

到2个峰, 与陆婕等(2006) 曾使用过的Sephadex G25fine 柱相比, 分离度明显提高。活性组分主要集中在第2个峰(即C 8~C 11组分) , 层析得到多肽质量共184 3mg, C 10和C 11组分除了能杀灭枯草杆菌和苏云金芽孢杆菌外, 还能杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌, 抗菌活性更强。计算活性肽得率时, C 活=C 1+C 8+C 9+C 10+C 11=129 0mg 。参照陆婕等(2006) 的方法, 组分B 1经95! 加热处理2h 后仍有抗菌活性; 此外, B 2和D 组分对4种细菌均有较强的抗菌活性(结果未显示) 。

表1 从蝇蛆提取的抗菌肽各组分的杀菌效果

Table 1 Antibacterial effect o f antibacterial fractions from Musca domestica larvae

菌株Bacteria s trai ns 枯草杆菌Bacillus subtilis 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 金黄色葡萄球菌Staphylococ cus aure us 铜绿假单胞菌

Pseudomonas ae ruginosa

A ----B 0++--B 1++--C 0++--C 1++--C 2~5----C 6+---C 7+---C 8++--C 9++--C 10++++

C 11++++

+:具有抑菌效果With antibacterial activi ty; -:没有抑菌效果Without antibacterial activi ty.

2 3 电泳结果

采用不同的电泳技术鉴定蝇蛆抗菌肽的分子量及等电点分布, 控制每孔上样量20 g, 经Tricine SDS PAGE 和IEF PAGE, 得到分子量回归方程Y =0 0262X +1 849(r =0 9942) , 等电点回归方程Y =-0 075X +9 416(r =0 9975) 。分析结果如下:(1) 与海藻酸吸附法提取的C 组分性质相似, 加热 层析法提取的抗菌肽B 1主要是分子量6 2~17 2kD(图3:a) 、pI 值5 59~5 91的弱酸性的小肽组分, 同时存在少量pI 值约8 88的弱碱性蛋白(图3:c) ; (2) C 组分中的抗菌肽主要是pI 值约5 59的弱酸性的小肽组分(图3:c) , 经Sephade x G50柱层析后, 活性最强的C 10和C 11中分子量约6 9kD 的小肽含量明显增加(图3:b) , 该小肽即陆婕等(2006) 曾报道过的新抗菌肽MD 7095; (3) 无活性的热沉淀A 中只有弱碱性蛋白(图3:c) , 进一步说明家蝇中的抗菌肽主要是弱酸性蛋白。有较强抗菌活性的B 2和D 组分经电泳后, 均未得到染色的蛋白条带, 多次实验结果均证明它们是非蛋白类物质(结果未显示) 。2 4 提取工艺分析

按2种提取工艺得到的抗菌肽的质量及得率见表2。活性肽得率计算公式:抗菌肽质量(g) 原料

质量(g) ∀100%。由表2可见加热 层析法的抗菌肽得率为0 26%, 是海藻酸吸附法提取抗菌肽得率

的5 2倍, 这有利于降低生产成本。实际操作中, 还可通过增加0 5mol L 乙酸浸提时间、次数等工艺改进, 进一步提高得率。

3 讨论

昆虫是自然界中最大的类群, 而蝇类又在昆虫家族中占很大比重, 但长期以来人们仅将其作为一种廉价优质的饲料蛋白资源, 对其医用价值未深入研究及充分开发和利用(贺继东和夏文水, 2002; 王明福等, 2004) 。

蝇类可以产生多种抗菌肽, 能对多种G 菌、G

+

-

菌、真菌和癌细胞有抑制或杀灭作用, 但目前的工艺研究尚处于实验探索阶段, 很难进行大规模生产。海藻酸吸附法是瑞典Karolinska 学院提取小肽的经典方法(陆婕等, 2006) , 海藻酸可有效地吸附小分子量蛋白, 在针对小肽的科研中具有重要的作用, 但其操作过程繁琐, 不利于抗菌肽产品的大规模生产制备。本研究探索并比较了多种提取工艺, 综合考虑提取得率、产品稳定性、工艺和成本等因素, 采用加

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昆虫学报Acta Entomologica Sinica 50卷

图3 2种工艺提取的蝇蛆抗菌肽的电泳图谱

Fig. 3 Electrophoresis of antibacterial pep tides extracted from Musca domestica larvae by two extraction methods respectively

a, b:Tricine SDS PAGE. 左Left l ane:通过计算预测的蛋白质分子量Predicted molecular weight of protein; 右Right lane:蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker. c:IEF PAGE. 右Right lane:通过计算预测的蛋白质等电点Predic ted pI of protein. MD 7095:陆婕等(2006) 报道的弱酸性抗菌肽A weak acid anti bac terial peptide reported by Lu et al . (2006) .

表2 2种提取工艺得到的抗菌肽组分的质量及得率

Table 2 Mass and ratio of antibacterial peptides purified by two extraction methods

提取方式Extraction method 加热 层析法Heat chromatography 海藻酸吸附法Alginic acid absorption

原料质量(g)

Crude material mass

250250

抗菌肽质量(g)

Antibacterial peptides mass

0 660 13

得率(%)

Extracti on ratio

0 260 05

热 层析法提取蝇蛆抗菌物质, 其抗菌肽得率为0 26%, 是海藻酸吸附法抗菌肽得率的5 2倍。由于抗菌肽对热很稳定, 在大规模生产中可采用喷雾干燥法, 从而进一步降低生产成本。

已报道的抗菌肽多为弱碱性, 纯化过程中多采用弱阳离子交换步骤, 上样之前需要调节样品溶液与洗脱液的pH 值平衡, 但这往往会影响抗菌肽的活性及得率, 且操作时间长, 步骤繁琐。等电点检测, 为弱酸性, 采用弱阳离子交换柱分离只能得到一个

不挂柱的主峰(陆婕等, 2006) , 分离效果并不明显, 故在实际操作中可省去离子交换步骤, 以减少操作过程对抗菌肽活性和得率的影响。在凝胶填料中, coarse 型比fine 型的凝胶粒度粗, 流速快, 分离效率高, 经常用于样品脱盐。根据实验摸索, 我们直接采用Sephadex G25coarse 柱对提取粗品进行层析分离, 在脱盐的同时, 还能有效分离蛋白和非蛋白组分, 大

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在摸索提取工艺的过程中, 我们还将蝇蛆酸提取液直接冻干后进行Sephadex G25coarse 柱脱盐层析, 结果得到与B 组分一样的分离效果和活性分布(图略) 。虽然加热 层析法提取抗菌肽的得率比直接冻干法抗菌肽的得率稍低, 但加热过程能有效去除外源性蛋白酶, 避免抗菌肽降解失活, 有利于保证产品的质量和稳定性。

蝇类的免疫系统中, 除了抗菌肽之外, 还可以产生多种抗菌物质, 如蝇类几丁糖也具有抗菌活性(雷朝亮等, 1998; 赖凡等, 1998, 1999) 。本研究中我们也发现, 除了抗菌肽外, 利用加热 层析法还能提取到较大量的有抗菌活性的非蛋白组分(B 2) , 该组分深褐色, 极易吸潮呈粘稠状, 推测其为几丁糖类物质, 尚待进一步化学鉴定。在实际生产中, 可以将该活性组分开发成为新的抗菌产品, 或者与抗菌肽一起使用, 通过更多抗菌组分之间的协调作用, 达到更好的抗菌效果。

应用基因工程方法生产抗菌肽是一种趋势, 但目前还存在不少问题有待深入研究, 如:进一步提高表达水平、包涵体复性、活性蛋白回收纯化、避免抗菌肽被内源的蛋白酶水解、提高基因表达产物的稳定性, 翻译后修饰对活性的影响等。除了工艺问题外, 还由于表达抗菌肽的种类单一而抗菌效果欠佳。我国是农业大国, 蝇蛆资源十分丰富, 从来源丰富、价格低廉的天然材料中纯化多种抗菌肽很有应用前景。

抗菌肽类产品与化学抗菌剂相比, 具有安全、无刺激等优点。本研究探索的加热 层析法提取蝇蛆抗菌肽方法简便, 同时还纯化出有抗菌活性的非蛋白组分(疑为几丁糖类物质) , 提示开发具有高附加值的抗菌产品, 如抗菌漱口液、抗菌滴眼液、妇洗液等, 还可以添加到面霜、洗面奶、洁肤水、去痘霜等化妆品中作为日常护肤之用, 将会有良好的应用价值和市场前景。

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(责任编辑:黄玲巧)