葡萄糖氧化酶的研究进展

食品与药品ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇ２０１０年第１２卷第０７期

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葡萄糖氧化酶的研究进展

刘

超’，袁建国２，王元秀１，李峰孙，高艳华２，韩省

（１．济南大学化学化工学院，山东济南２５００２２；２．济南京鲁生物中心，山东济南２５００１３）

摘要：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，对人体无毒、副作用，能利用氧将葡萄糖氧化成葡萄糖酸而有效除氧，因而广泛用于抗氧化剂、葡萄糖酸、尿糖试纸和生物传感器的生产。本文综述了葡萄糖氧化酶的研究进展。关键词：葡萄糖氧化酶；生物传感器；葡萄糖酸；应用中图分类号：ＴＱ９２５＋Ａ

文献标识码：Ａ

Ｐｒｏｇｒｅｓｓ

ＬＩＵＣｈａｏｌ，ＹＵＡＮ

文章编号：１６７２．９７９Ｘ（２０１０）０７．０２８５—０５

ｏｎ

ＧｌｕｃｏｓｅＯｘｉｄａｓｅ

Ｊｉａｎ—ｇｕ０２，ＷＡＮＧＹｕａｎ—ｘｉｕｌ，ＬＩＦｅｎ９２，ＧＡＯＹａｎ—ｈｕａ２，ＨＡＮＳｈｅｎ９１

（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌｌ曼ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｆｙｏｆＪｉｎａｎ，ｄｉｎａｈ２５００２２，Ｃｈｉｎａ；

２．ＪｉｎｇｌｕＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＧｌｕｃｏｓｅＳｉｎｃｅｉｔ

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ａｎｄｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒ

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ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ．

Ｗｏｒｄｓ：ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ；ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；ｇｌｕｃｏｎｉｃ

ａｃｉｄ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ

葡萄糖氧化酶（ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ，Ｅ．Ｃ．１．１．３．４，ＧＯＤ）在有氧条件下能专一性地催化ｆｌ－Ｄ．葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢Ⅲ（图１）。ＧＯＤ广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产ＧＯＤ的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。目前ＧＯＤ的应用领域不断

拓展，国内外市场需求量急剧增加。

产量低、酶活低、检测方法复杂是ＧＯＤ产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的ＧＯＤ厂家主要是德国的Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ和日本的ＴＯＹＯＢＯ。１９７０年代我国成立ＧＯＤ研究协作组，展开了系

收稿日期：２０１０．０１．１８

作者简介：刘超（１９８７．），男，山东临沂人，硕士研究生，发酵工程和酶工程专业Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｃｈａｏ．ｇｏｏｄ＠１６３．ｃｏｒｎ’通讯作者：李峰，男，高级工程师，研究方向为发酵工程和酶工程Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｌｕ２０８８＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ

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２８６食品与药品ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇ２０１０年第１２卷第０７期

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２

ＧＯＤ的结构和酶学性质

２．１酶的结构

ＧＯＤ是同型二聚体分子，含有２个黄素腺嘌呤二核苷酸（ＦＡＤ）结合位点。每个单体含有２个完全不同的区域：一个与部分ＦＡＤ非共价但紧密结合，主要为声折叠；另一个与底物∥一Ｄ．葡萄糖结合，由４个ｎ．螺旋支撑１个反平行的声折叠Ⅲ。

２．２酶学性质

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统研究。

ｌ

图１ＧＯＤ催化反应图

ＧＯＤ的抗氧化作用机制‘２ｌ

ＧＯＤ能消耗分子氧或原子氧氧化葡萄糖，保护食

高纯度ＧＯＤ为淡黄色晶体，易溶于水，可制成液体制剂。ＧＯＤ完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有机溶剂。ＧＯＤ相对分子质量一般在１．５

Ｘ

品中的易氧化成分。按反应条件ＧＯＤ催化反应有３种形式：

（１）没有过氧化氢酶存在时，每氧化１ｔｏｏｌ葡萄糖

１０５左右，每分子酶含２分子ＦＡＤ。ｐＨ作

消耗ｌｍｏｌ氧：Ｃ６Ｈ１２０６＋０２一Ｃ６Ｈ１２０７＋Ｈ２０２；声－Ｄ－葡萄糖＋Ｏ：一卢一Ｄ．葡糖内酯＋Ｈ：Ｏ：（２）有过氧化氢酶存在时，每氧化ｌｔｏｏｌ葡萄糖消耗１／２ｔｏｏｌ氧：Ｃ６Ｈ１２０６＋１／２０２一Ｃ６Ｈ，２０，＋Ｈ：０２（３）有乙醇及过氧化氢酶存在时，过氧化氢酶可用于乙醇的氧化，每氧化１ｔｏｏｌ葡萄糖消耗ｌｍｏｌ氧：Ｃ６Ｈ１２０６＋Ｃ２Ｈ５０Ｈ＋０２一Ｃ６Ｈ１２０７＋ＣＨ３ＣＨＯ＋Ｈ２０２

此外，ＧＯＤ对ｆｌ－Ｄ．葡萄糖表现出强烈的特异性，葡萄糖分ｚ子Ｃｏ）上的羟基对酶的催化活性至关重要，且羟基处于

用范围３．５～６．５，最适ｐＨ５．０左右，在没有保护剂存在的条件下ｐＨ＞８．０或ｐＨ＜３．０时会迅速失活。ＧＯＤ的作用温度范围一般为３０～６０℃。固体酶制剂在０℃下至少可保存２年，一１５℃下可保存８年哆】。

３

ＧＯＤ生产的研究ＧＯＤ的来源

３．１

从动植物组织中提取ＧＯＤ有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌ＧＯＤ产酶量少；一般采用黑曲霉（具有ＧＲＡＳ资格）和青霉属菌株作为ＧＯＤ生产菌。生产ＧＯＤ的主要菌株见表１。

我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产ＧＯＤ，日本常用尼崎青霉，俄罗斯用生机青霉，近年报道胶

雎时的活性要比在口位时高约１６０倍。底物ｃ（２），ｃ（”ｃ（４），

Ｃ（５），Ｃ（６）结构的改变也会大大影响其酶活性，但酶活性仍有部分保留。葡萄糖氧化酶对三．葡萄糖和２．Ｄ．甲基．Ｄ．葡糖则完全没有活性例。

表１生产ＧＯＤ的主要菌株

主要来源细菌

生产菌株名称

弱氧化醋酸菌

点青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｎｏｔａｔｕｍ）、产黄青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、镰刀霉属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、柠檬酸霉属（Ｃｉｔｒｏｍｙｃｅｓ）、

霉菌

米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、灰绿青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｇｌａｕｃｕｍ）、紫色青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｎｏｔａｔｕｍ）、产黄青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）紫色青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｐｕｏｐｕｒａｇｅｎｕｍ）、黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）尼崎青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ）、生机青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｕｉｔａｌ）

霉属（Ｃｌｉｏｃｔａｄｉｕｍ）、拟青霉属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）和帚霉属（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）也能生产ＧＯＤ。

３．２

Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎ等旷１先后在酵母中表达了ＧＯＤ，并用于酿造啤酒；Ｓｚｙｎｏｌ在大肠杆菌中表达了ＧＯＤ佴１。周亚风等ｐ１在酵母中高效表达黑曲霉ＧＯＤ基因：彭昊等【ｌ哪利用根癌农杆菌介导将ＧＯＤ基因转入水稻；母敬郁等用瑞氏木霉表达了黑曲霉ＧＯＤ；２１世纪是分子技术的世纪，ＧＯＤ基因必将在各种生物组织中得到表达，ＧＯＤ的应用范围和规模将进一步扩大。

ＧＯＤ生产的研究进展

３．２．１生产菌株改良传统方法是通过紫外线、丫射线和亚硝基胍（Ｎｏｍｅｈｔｙｌ—Ｎ－ｎｉｔｏｒ－Ｎ－ｎｉｒｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＮＴＧ）等诱变菌株嘲。目前国外主要用基因克隆、表达等提高菌株的产酶活力，并取得了显著成绩。

食品与药品

ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇ３．２．２发酵工艺优化

研究人员全面研究了不同菌株的产酶条件。Ｆｉｅｄｕｒｅｋ［Ⅲ筛选出１株能在淀粉上生长的黑曲霉ＧＩＶｌ０；Ｌｉｕ【１２ｌ、Ｇａｎａｄｕ等先后研究了黑曲霉及青霉的发酵工艺，并用不同方法优化产酶条件；Ｍｉｒｏｎ“列通过浸没培养黑曲霉发酵菌株优化生产ＧＯＤ；江洁等”４１研究了ＧＯＤ膜过滤发酵工艺，在发酵过程中引进带有膜过滤器的外循环系统（图２），产酶速率提高了３倍；中国科学院微生物研究所曾筛选出１株青霉菌（Ｐ１５０），以液化淀粉培养液替代蔗糖作碳源，具有相当高的产酶能力，降低了ＧＯＤ生产费用，但是，后续的提纯操作有一定的难度。

注：１－滤液罐；２－蠕动泵；３・膜过滤器：４・膜；５－发酵罐；６一

补糖罐；７一补料罐

图２膜过滤发酵流程图

３．２．３酶固定化和酶电极酶固定化有物理方法和化学方法【ｌ”，物理方法主要有包埋法、吸附法；化学方法主要有化学交联法和共价键法。

近年生物传感器及生物芯片引起了极大关注，葡萄糖传感器的研究不断有新的进展，如活体测试用过氧化聚吡啶膜固定ＧＯＤ的针状微电极，普鲁士蓝硅酸盐媒介的二氧化硅凝胶葡萄糖生物传感器和皮下植入式葡萄糖传感器等，引起了国内固定化酶和酶电极研究的热潮。２００７年北京工业大学生命科学与技术学院将ＧＯＤ固定在管状空心载体Ｓｉｏ，上增强其稳定性；李建平等”叼研制了基于Ｆｅ，ＯＪＡｕ／ＧＯＤ的新型磁性敏感膜葡萄糖传感器。

３．２．４

ＧＯＤ的生产概况早在上个世纪４０年代国外就

有ＧＯＤ产品出售；５０年代日本获得了结晶ＧＯＤ，６０年代日本长赖工业公司开始出售ＧＯＤ；到７０年代ＧＯＤ在国外的应用已经很普遍了。

１９６６年中国科学院微生物研究所选育了ＧＯＤ优良菌株并投入生产。７０年代成立了ＧＯＤ研究协作组，开展了系统研究。从２００４年至今，ＧＯＤ己广泛

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用于饲料添加剂，代表产品为鲜尔康。目前我国虽已有ＧＯＤ商品出售，但酶制剂纯度及活性普遍较低，稳定性差，生产成本高，主要仍依赖进口。

４

ＧＯＤ活性测定

ＧＯＤ活性测定一般采用邻．联（二）茴香胺分光光度法。在有氧条件下，ＧＯＤ催化葡萄糖脱氢产生Ｈ：Ｏ：，在过氧化物酶（ＰＯＤ）作用下，氧供体邻．联（二）茴香胺（ＤＨ２）被氧化成棕色产物。狈１Ｊ４６０ｎｎｌ处吸光度的变化，可换算ＧＯＤ的活性。常用的方法还有Ｕｎｄｅｒｂｏｆｌｅｒ滴定法、靛蓝胭脂红褪色分光光度法等。

５

ＧＯＤ的分离纯化

提取ＧＯＤ有多种方法。常规方法有乙醇、丙酮、硫酸铵、单宁酸沉淀法；氧化铝、苯甲酸、离子交换树脂吸附法；真空浓缩成液体酶制剂法；亲和色谱法以及结晶法等。还可使用一些特殊方、法【堋。ＧＯＤ主要用于食品工业，因而选择合适的制备方法十分重要。为寻求更佳的分离纯化方法，Ｋｅｙｅｓ先将ＧＯＤ用无机氧化剂如ＮａＩＯ。或酶改性剂改性后，再用琼脂糖４Ｂ进行柱色谱，效果很好。

６

ＧＯＤ的应用

ＧＯＤ广泛应用于食品、医药领域，见图３。

ｌ葡萄糖氧化酶Ｉ

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生物方面

其它一

］［

传感器电极一ｌｌ葡萄糖酸钙一

饲料一

图３ＧＯＤ应用的领域

６．１食品行业

６．１．１去葡萄糖食品加工工艺中部分糖蛋白分解后，还原糖的醛基和氨基酸的羧基会产生美拉德反应，使产品褐变。用ＧＯＤ．过氧化氢酶组合系统处理食品，能将葡萄糖分子上的醛基转变为羧基，生成葡萄糖酸，消除美拉德反应。常应用于蛋品、马铃薯制品，果酱制品以及海鲜中，延长了产品的货架期“引。６．１．２脱氧含有黄酮、亚油酸、亚麻酸等还原性物质的食品，如果汁、茶饮料、葡萄酒、啤酒、蛋黄酱、果酱等，存在氧会使还原性物质氧化，致使产品浑浊、沉淀、变色。加入适量ＧＯＤ或ＧＯＤ．过氧化氢酶复合物，可有效地保护食品中的还原性物质。

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６．１．３杀菌ＧＯＤｆ毙阻止好氧菌生长繁殖，产生过氧化氢，起到杀菌作用。

６．１．４葡萄糖的定量分析ＧＯＤ能专一氧化葡萄糖，故可用于测定各种食品和混合物中葡萄糖的含量。目前用固定化技术制成的ＧＯＤ分析仪已用于测定发酵液的残糖量【”ｌ。据此原理制成的葡萄糖测定试剂盒，可定量测定果汁、饮料及牛奶等多种食品中葡萄糖的含量。

ＧＯＤ与葡萄糖反应生成葡萄糖酸的同时产生强氧化剂过氧化氢，能将面筋分子中的巯基（一ＳＨ）氧化为二硫键（．Ｓ－Ｓ．），可取代对人体有致癌作用的溴酸钾，增强面筋强度和面团延展性，增大面包体积。

６．２医药行业

６．２．１尿糖试纸尿糖试纸检测尿液中的葡萄糖含量，其原理是ＧＯＤ酶促反应中产生的过氧化氢被过氧化氢酶催化分解，产生水和原子氧。原子氧将试纸上的还原性无色邻联甲苯胺染料氧化成蓝色物质，其生成量与葡萄糖浓度成比例，从而可推断葡萄糖的量。６．２．２血糖试纸ＧＯＤ与过氧化物酶偶联的ＧＯＤ．ＰＯＤ法测定血糖含量的试剂已商品化，因操作简单、无毒、无害、易控制，已广泛应用于临床。

６．２．３生产葡萄糖酸以葡萄糖为底物用ＧＯＤ生产葡萄糖酸，然后进一步生产葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钙和葡萄糖酸锌等补充微量元素的保健品。

６．３生物方面

近年，生物传感器及生物芯片中ＧＯＤ电极传感器的研究最具商品价值。ＧＯＤ是生物传感器领域最主要的工具酶。ＧＯＤ生物传感器可用于在线检测发酵过程中葡萄糖的浓度，以控制食品加工生产过程和检验葡萄糖的含量口们。根据ＧＯＤ在反应中消耗氧的量，应用一种蛋壳膜传感器，监测植物种子中氧的消耗。此种方法不受种子中干扰物的影响，测定数据准确Ⅲ】。酸性环境中，Ｈ９２＋能与ＧＯＤ活性中心的某些位点结合，从而抑制其活性。近年根据此原理研制成一种酶生物传感器，用于测定土壤浸出液中汞离子回收率［２ｚｌ。根据单克隆抗体抗链霉素、磺胺类药物及青霉素的免疫学原理，建立ＧＯＤ半抗原快速测定技术，分析牛奶中的抗生素，具有灵敏、专一、快速等优点口３１。

６．４其他方面

ＧＯＤ能去除氧，可用于金属器械防腐；ＧＯＤ可

产生过氧化氢，可用固定化ＧＯＤ漂白某些纺织品Ⅲ】。ＧＯＤ还可用于植物喷洒剂及饲料添加剂。鸡饲料中添ｊＪＨＧＯＤ，能催化鸡肠道内葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，抑制大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、弧菌，保护鸡肠道上皮细胞的完整性，改善肠道酸性消化环境，提高饲养鸡的成活率㈣。７问题及展望

目前规模化生产高活性的ＧＯＤ还有困难。发酵生产ＧＯＤ的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。国内ＧＯＤ产量与国外报道的最高产量

ｌ２０

Ｕ／ｍＬ尚有差距，有待提高。酵母菌的基础研究

较透彻，生长代谢速度快，是目前最有潜力的改造菌株，但基因工程构建菌株耗资大，菌株易退化，工业生产还有难度。

利用ＧＯＤ延长食品的保质和保鲜期是非常有潜力的课题。ＧＯＤ在动物体内的作用方式、最佳作用条件、代谢过程有待研究。如何更经济、更有效地制备和提纯ＧＯＤ也是今后研究的方向。随着研究的不断深入，ＧＯＤ的应用前景将会更加广阔。

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我国食品冷链物流安全现状与对策

张玉华，孟

一，候成杰，王国利

（国家农产品现代物流工程技术研究中心山东商业职业技术学院山东省农产品贮运保鲜技术重点实验室，山东济南２５０１０３）摘要：我国食品冷链物流存在安全隐患，导致物流过程损耗严重，食品质量安全无法保证。针对食品冷链物流存在的问题，提出了质量安全保障措施。

关键词：冷链物流；食品安全：安全保障中图分类号：ＴＳ２０１．６

文献标识码：Ａ

文章编号：１６７２．９７９Ｘ（２０１０）０７－０２８９－０３

ＳａｆｅｔｙＳｉｔｕａｔｉｏｎａｎｄＣｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｏｆＦｏｏｄＣｏｌｄ－ｃｈａｉｎＬｏｇｉｓｔｉｃｓｉｎＣｈｉｎａ

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ＰｒｏｄｕｃｔｓＬｏｇｉｓｔｉｃｓ，ＳｈａｎｄｏｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｏｍｍｅｒｃｅａｎｄ

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ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｊｉｎａｎ

２５０１０３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｒｅｉｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｓａｆｅｔｙｈａｚａｒｄｉｎｆｏｏｄｃｏｌｄ—ｃｈａｉｎｌｏｇｉｓｔｉｃｓｉｎＣｈｉｎａ，ｗｈｉｃｈｌｅａｄｓｔｏｌｏｇｉｓｔｉｃｓ．Ｆｏｏｄｑｕａｌｉｔｙａｎｄｓａｆｅｔｙ

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ｉｎｓｕｒａｎｃｅ

ｓａｆｅｇｕａｒｄｍｅａｓｕｒｅｓｏｆｑｕａｌｉｔｙａｎｄｓａｆｅｔｙＫｅｙ

Ｗｏｒｄｓ：ｃｏｌｄ－ｃｈａｉｎｌｏｇｉｓｔｉｃｓ；ｆｏｏｄｓａｆｅｔｙ；ｓａｆｅｔｙ

近年，公共食品安全保障体系建设受到各国政府和消费者的普遍关注，我国政府也高度重视并采取了一系列措施加强食品安全管理工作【¨。但目前我国食品质量安全形势依然严峻。由于长期以来食品安全的关注点主要在生收稿日期：２０１０－０１．１２

产加工过程上，食品物流是我国食品安全的薄弱环节。食品物流损耗严重，品质下降，食品安全事故频发。要保证食品物流安全，必须确保食品物流的技术、设备及操作标准化，制定相关政策与法规，建立安全保障机制和管理体

作者简介：张玉华（１９７３．），女，博士，副教授，研究方向为食品质量安全Ｅ－ｍａｉｌ：ｚ１１ｆ＠１６３．ｃｏｒｎ

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