荧光分析法在生物领域的应用于发展

荧光分析法在生物领域的应用于发展 摘要：本文对荧光分析法在检测细胞活性，测定生物样品，推断生物成虫日龄，研究生物群落动态的应用与进展进行了综述与分析。并就其包含的不同方法进行一一介绍，展望了荧光分析法技术在生物领域中的应用前景。

关键词:荧光分析法生物领域应用发展

引言：利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。当照射停止后，如化合物的发射在10-9秒钟内停止，则称荧光超过此限度即称为磷光。特点：灵敏度更高 10-10-10-12g/ml，应用不如UV广泛。SO2分子受特定光照射后处于激发态的SO2分子返回基态时发出荧光, 其荧光强度与SO2呈线性关系, 从而可测出气体浓度。当检测仪器系统确定后，荧光总光强I与SO2浓度的之间的关系可表示为：I=KC 在稳定的条件下，这些参数也随之确定，k可视为常数。因此，式I=kC表示的紫外荧光光强I与样气的浓度C成线性关系。这是紫外荧光法进行定量检测的重要依据。 荧光色谱法相关内容

1. 荧光色谱法的近期发展状况

（1）近10年来,由于微量分析的需要迅速增加,灵敏度高选择性强的荧光分析法日益受到重视。有关文献数量猛增,内容也从一般仪器及分析方法介绍发展到高精度、高灵敏度、自动化、多用途的新仪器新技术研究。荧光分析对象从以无机样品为主发展到以有机及生化样品为主,并从成分分析向化学结构、化学形式、微观分析、空间分布等状态分析发展,应用遍及各个领域。荧光光谱图册也陆续出版,美国费城Sadtler研究实验室自1974年起出版标准荧光光谱图及各专用荧光光谱图(如药物)。荧光分析法的应用范围与发射光谱法、火焰光度法、质谱法等相仿,成为一种重要的仪器分析方法。

（2）荧光分析法在纳米生物分析中的应用巨大。纳米荧光探针、纳米生物传感器等纳米生物分析材料器件的特性及其在生物分析中的应用。对发光量子点、复合型荧光纳米粒子和具有光学活性的金属纳米粒子作为生物分子的标记探针取得了成果。【1】

2.荧光分析法基本原理分子角度

分子的激发态，单线激发态和三线激发态

大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=½+(-½)=0，其多重性 M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”

图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）

当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即ÄS=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态” 比 “单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态 → 单线态过程的 10-6~10-7。

3.荧光分析法的注意事项

（1） 荧光的减退

荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化作用，会使荧光逐渐减退。

（2）试剂的浓度

有些试剂能吸收紫外线，有颜色的试剂还有吸收荧光的作用，因此分析时所加试剂的量不可太多。

(3)pH的影响

大多数荧光反应都受溶液酸碱度的影响，故荧光分析需在适合的酸碱度溶液中进行。最适当的酸碱度必须由实验来确定。所用酸的种类也影响荧光的强度，例如，奎宁在硫酸溶液中的荧光较在盐酸中的要强些。

4.荧光分析法生物领域具体内容

a荧光分析法检测细胞活性

应用二乙酸荧光素(FDA)-溴化乙锭(EB)双染色同步荧光分光光度法测定细胞活性变化,灵敏度和特异性与普通荧光分光光度法相比较有所提高。方法 FDA-EB对已知比例的死、活细胞双染色,选择△入=40nm进行同步荧光扫描,与普通荧光分光光度法测定值进行比较。结果 该方法与通常的荧光法相比,灵敏度有较大提高,并能确定溶液中死、活细胞比例关系。结论 FDA-EB双染色同步荧光分光光度法可用于细胞活性变化的定性定量分析。【2】【3】

【4】

b荧光分析法测定生物样品

通过电化学氧化肾上腺素,使其生成羟基吲哚类荧光物质(λem=490nm),实现了药物中肾上腺素含量的电化学氧化-荧光检测。研究结果表明,荧光强度与肾上腺素浓度分别在2.00×10-7—1.00×10-6mol/L和1.00×10-6—4.00×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为6.70×10-8mol/L。该方法用于药物制剂中肾上腺素含量的测定,相对标准偏差小于1.88%(n=7),加标回收率为88.4%—116.6%。【5】【6】【7】【8】【9】【10】

c荧光分析法推断生物成虫日龄

蝶啶荧光分析法用于绯颜裸金蝇Achoetandrusrufifacies成虫日龄及进一步用于死亡时间推断的潜力。方法:将A.rufifacies成虫于16、20、24、28和32℃5种恒温下饲养,此后取样1次/2~3 d。取各日龄雌、雄成虫头壳于Tris-HCl(pH 8·0)缓冲液中匀浆,离心,用荧光分光光度计测定上清液的荧光强度。结果:在5种恒温下,雌、雄成虫头壳蝶啶含量与日龄均呈显著的线性关系(r2>0·87,P0·87,P0·52,P

d荧光分析法研究生物群落动态

目前常用于分析色素浓度的分光光度法灵敏度较低，当样品中色素含量很低时，难以检出【14】。也有研究曾经采用了同步荧光法测定了海洋浮游植物的叶绿素【15】，但至今还未见用于湖泊底泥中色素分析的报道.Yuk。等人应用高效液相色谱(HPLC)法分析了Baikal湖湖泊沉积物中的色素L，该方法检测限很低，灵敏度极高.但此法样品前处理过程较为复杂，且成本较高.而荧光分析法灵敏度较高，所需样品量少，更为简便、快速和经济.虽然蓝藻一般在夏季形成水华，但是认识藻类在底泥中初春的动态规律有助于了解水华形成的机理.本文以太湖梅梁湾地区的底泥为材料，利用荧光分析法测定藻蓝素含量，并用同步荧光分析法同时测定湖泊底泥中的叶绿素a、叶绿素b含量，目的是利用不同色素的定量分析来表征底泥中不同类群藻类的比例，为探讨不同季节底泥中水华蓝藻存在状态与春季蓝藻复苏以及随后水华发生的时空关系提供技术支持。

5.荧光分析法及其衍生的前景展望

生物分析已成为现代分析化学发展的最重要的前沿领域之一。为了适应这种形势的要求，众多分析化学工作者正在不断努力开发着新的方法和技术。纳米尺度上的生物分析化学就是其中的一个重要代表。纳米生物分析材料和器件及其在生物分析中的应用是当今国际分析科学领域的研究前沿及发展方向之一，是各国关注重视的研究热点。在生物医学及生命科学中应用最多的是分子光谱分析方法。其中由于荧光光谱的灵敏度高选择性好，因此对分子荧光方面的研究更是十分活跃。纳米生物分析和荧光法的结合最为紧密。本文对荧光分析法在纳米生物分析中的应用研究进展进行了综述。

荧光探针作为研究生物大分子（如：核酸、蛋白质）的有力工具，在 20 世纪 90 年代取得了长足的进展，新的靶扩增技术（PCR）已日臻完善，发光标记探针也已经与放射性同位素标记具有同等重要的地位，而且已应用于 DNA 杂交研究、疾病诊断和食品微生物检测等方面。荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色，DNA 电泳，核酸分子杂交，定量 PCR 技术以及 DNA 测序上都有着广泛的应用前景。

6.参考文献

【1】陈国珍，黄贤智，许金钩，等．荧光分析法[M]．北京：科学出版社，1990：93-134．

【2】边兴艳. MTT比色法及其应用〔J〕.国外医学.临床生物化学与检验学分册,1998,19(2):83～85

【3】张先杰.台盼蓝染色与FDA/PI双染色对检测肝细胞活率的评价〔J〕.首都医科大学学报,2000,21(3):258

【4】陈国珍等著.荧光分析法〔M〕.北京:科学出版社第二版,1990 .

【5】Burtis C A,Ashwood E R.TietzTestbook of Clinical Chemistry[M].Philadelphia:Saunders W.B.,1998.1570—1572.

【6】Goodman L S,GilmanA.The Pharmacological Basis of the Rapeutics,Ninthed[M].New York:McGraw-Hill,1996.105—112.

【7】NagarajaP,Vasantha R A,Sunitha K R.A New Sensitive and Selective Spectrophotometric Method for the Determination ofCatechol Derivatives and Its Pharmaceutical Preparations[J].J.Pharmaceut.Biomed.Anal.,2001,25(3—4):417—424.

【8】OosterhuisB,BruntK,Westerink B H Cetal.Electrochemical Detector Flow Cell Based on a Rotating Disk Electrode forContinuous Flow Analysis and High Performance Liquid Chromatography of Catecholamines[J].Anal.Chem.,1980,52(1):203—205.

【9】刘诚,黄俊,肖海燕.肾上腺素的检测进展[J].传感器与微系统,2006,25(11):1—4.

【10】王立世,杨晓云,莫金垣.毛细管电泳扫描伏安电化学法分离检测肾上腺素,氯丙嗪和异丙嗪[J].色谱,1999,17(5):435—437.

【11】胡萃,马玉.法医昆虫学的历史、现状及今后展望[J].昆虫知识, 1995, 32(3): 184-186.

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【13】胡萃.法医昆虫学[M].重庆:重庆出版社, 2000. 366.

【14】翟文川，潘红玺，苏晨伟.紫外可见分光光度法对湖泊沉积物中的色素测定.分析测试技术与仪器，1995，1(4少:36一39

【15】朱明远，邢军，吴宝铃.两种荧光分析法在海洋浮游植物叶绿素测定中的应用.青岛海洋大学学报，1994，24(4):533一538