发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种分离及鉴定

微生物学通报 MAR 20, 2010, 37(3): 407412 Microbiology China 2010 by Institute of Microbiology, CAS

[email protected]

摘 要: 采用改良MRS培养基从蒙牛冠益乳酸奶中选择性分离得到2种乳酸菌, 表型特征检测初步确定目标菌株BB-12, 该菌株符合双歧杆菌属特征描述。通过Biolog微生物自动鉴定系统鉴定、16S rDNA序列分析、atpD基因序列分析, 多相鉴定表明: 菌株BB-12为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)。系统发育学分析表明: atpD基因序列比16S rDNA序列在动物双歧杆菌亚种水平鉴定上有更好的分辨率。

关键词: 动物双歧杆菌, atpD基因, 改良MRS培养基, 多相鉴定, Biolog

Isolation and Identification of Bifidobacterium animails

subsp. lactis in Fermented Milk Products

ZHAO Ting1 HAN Hui2 LIU Bo1 LI Hui1 CHENG Chi1*

(1. China National Research Institute of Food & Fermentation Industries, China Center of Industrial Culture Collection,

Beijing 100027, China)

(2. Chr. Hansen (Tianjin) Food Ingredient Co. Ltd. Beijing Branch, Beijing 100026, China)

Abstract: Two strains were selectively isolated from the sample of Mengniu fermented milk product on modified MRS medium. Strain BB-12 was selectived by morphology observation, it was consistent with the characteristics of Bifidobacterium sp.. On the basis of polyphasic approach: morphology, physiology and molecular properties, it was evident that the strain BB-12 belonged to Bifidobacterium animalis subsp. lactis. Analysis of 16S rDNA sequences (GenBank accession No. GU116483) and atpD gene sequences (GenBank accession No. GU116482) revealed that the latter had clear separation of two subspecies while the former was not possible since their sequences displayed at least 99.1% homology.

Keywords: Bifdobacterium animails, atpD gene, Modified MRS, Polyphasic approach, Biolog 双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)是一类常用于食品添加的益生菌, 其中的一些种对胃酸和胆汁盐有较好的耐受性, 可有效补充肠道益生菌群, 具有维护肠道生态平衡和促进人体健康的作用, 广泛应用于益生菌乳产品、食品添加剂及医药行业中[1]。目

基金项目：国家科技支撑计划项目(No. 2007BAK36B06); 国家自然科技资源基础条件平台项目(No. 2005DKA21204) *通讯作者：Tel: 86-10-64616613; : [email protected] 收稿日期：2009-10-20; 接受日期：2009-12-09

前市场上含双歧杆菌的益生菌产品, 大多由多种益生菌组成, 并以双歧杆菌和乳酸菌联合使用为多, 动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)和乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)是其中两个重要的种, 与动物双歧杆菌比较, 乳双歧杆菌显示了更好的

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氧耐受性[2], 保证其在商业乳产品中可以达到很高的菌数。

国家食品药品监督管理局为进一步规范用于生产普通食品和婴幼儿配方食品的菌种, 确保人体健康和食品质量安全, 在2009年3月卫生部监督局发布关于公开征求《可用于生产普通食品的菌种名单》和《可用于婴幼儿配方食品的菌种名单》意见的函(卫监督食便函〔2009〕74号)中把动物双歧杆菌(B. animalis)和乳双歧杆菌(B. lactis)分别列入《可用于生产普通食品的菌种名单》和《可用于婴幼儿配方食品中的菌种名单》中[3]。为了保证此类产品的质量及正确标识, 明确工业用微生物菌株的分类地位并快速准确检测其含量显得非常重要。

自Meile等[2]对乳双歧杆菌进行了首次描述以来, 对于该菌分类地位的争论从未停止。一些研究显示了其与动物双歧杆菌的密切相关性, 曾将其描述为动物双歧杆菌[4]。基于形态学特征、16S rDNA序列分析和DNA-DNA杂交[5], Cai提议乳双歧杆菌应该被认为是动物双歧杆菌的同物异名。但是, 新的基因证据, 如Ventura和Zink[6]、Zhu等[7]、Liesbeth Masco 等[8]所报道的, 认为乳双歧杆菌和动物双歧杆菌应该在亚种水平被划分为两个分类单元, 明确了其分类地位, 将动物双歧杆菌重新分类为动物双歧杆菌动物亚种, 将乳双歧杆菌重新分类为动物双歧杆菌乳亚种。目前, 国内对种以下分类单元的鉴定方法研究很少。

本文通过参阅国内外有关文献及双歧杆菌、乳酸菌计数的标准[914], 认为科汉森(天津)食品添加剂有限公司企业标准[14]是一种简单易行快速准确的双歧杆菌活菌计数方法, 参考该方法对市售蒙牛冠益乳酸奶中双歧杆菌进行了选择性分离, 并对目标菌株在亚种水平进行了多相鉴定, 旨在为食品行业中特定微生物的快速检出计数及明确标识提供技术依据。

1 材料

1.1 样品与菌株

供试样品: 蒙牛冠益乳酸奶(250 g/杯), 生产批号H20080605 [其中含有双歧杆菌BB-12 (Bifido-bacterium BB-12)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus aci-dophilus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、

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保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus) 4种乳酸菌]。

1.2 培养基及试剂

MRS琼脂培养基: Difco 288210;

双氯青霉素钠盐溶液(10 g/L): Sigma D-9016, 0.45 μm孔径微孔滤膜过滤除菌;

LiCl溶液(0.1 g/mL): Merck No. 5679, 0.45 μm孔径微孔滤膜过滤除菌;

盐酸半胱氨酸溶液(100 g/L): Merck No. 2839; 改良MRS琼脂培养基: 每升MRS琼脂培养基(Difco 288210)中加入5 mL双氯青霉素钠盐溶液, 加入10 mL LiCl溶液, 加入5 mL盐酸半胱氨酸溶液;

厌氧培养产气剂购自日本三菱MGC; Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker购自天根生化科技有限公司;

GoldView购自北京塞百盛基因技术有限公司; 溶菌酶购自Sigma公司; 蛋白酶K购自Merck公司;

其他化学药品均为进口分装或国产分析纯。

2 方法

2.1 菌株的分离纯化[10]

称取蒙牛冠益乳酸奶(250 g/杯) 5 g至45 mL 0.85%灭菌生理盐水中(加适量玻璃珠)作为母液, 振荡10 min充分混匀, 用无菌操作方法用1 mL灭菌吸管吸取1 mL菌液做10倍梯度稀释, 选择3个合适的稀释度, 每一稀释度取0.1 mL滴于预先倾注好的改良MRS培养基平板表面, 每个稀释度同时做2份, 用灭菌涂布棒均匀涂布, 并同时做稀释液的空白对照。平板倒置于厌氧培养罐中37C培养 72 h ± 3 h。进行菌落形态和细胞形态观察。

2.2 Biolog全自动微生物鉴定系统对菌种的鉴定[15]

将菌株接入厌氧菌培养基Biolog Universal Anaersal (BUA) + 5%羊血(B), 37C培养24 h。接种液选用厌氧菌鉴定微平板(AN-IF), 接种液浊度65%, 接种量AN/100 μL, 37C培养24 h。

将厌氧菌鉴定微平板(AN-IF)放入Biolog全自动微生物鉴定仪, 观察板中96孔的颜色变化, 使用Biolog Micro Station System 4.2软件分析, 机器读板

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结果直接与数据库比较, 记录结果。 2.3 atpD基因及16S rDNA序列鉴定

2.3.1 基因组DNA提取: 基因组DNA提取方法参照文献[16]。

2.3.2 atpD基因和16S rDNA序列的扩增及检测: 以菌株BB-12基因组DNA为模板, 以atp-1和atp-2为引物, 对atpD基因进行扩增。引物序列为atp-1: (5′-CACCCTCGAGGTCGAAC-3′), atp-2: (5′-CTGC ATCTTGTGCCACTTC-3′)[8]。PCR混合液反应体系50 μL包含20 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 200 μmol/L dNTP, 50 pmol引物, 1.5 mmol/L MgCl2, 1 U Taq DNA聚合酶。PCR扩增反应程序: 95C 3 min; 95C 30 s, 50C 30 s, 72C 2 min, 30个循环; 72C 10 min; 4C保存。以菌株BB-12基因组DNA为模板, 以27F和1541R为引物, 对16S rDNA序列进行扩增。引物序列为27F: 5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′, 1541R: 5′-AAGGAGGTGATCCACCC -3′[16]。PCR反应体系除引物不同外, 其他与atpD基因PCR反应体系相同。PCR扩增反应程序: 95C 5 min; 95C 1 min, 56C 1 min, 72C 1 min 30 s, 35个循环; 72C 10 min; 4C保存。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分离检测, 染料为Goldview。 2.3.3 序列测定、分析及系统发育树的构建: 纯化后的PCR产物用ABI3700基因测序仪测序。测序由北京宝杰罗生物技术有限公司完成。测序结果用Chromas软件参照正反序列图谱人工校对。由GenBank获得乳杆菌属相关菌株atpD基因序列, 以Clustal X[8]进行序列比对后, 用MEGA 3.1的Neighbor-joining法构建系统发育树[8], 并进行1000次Bootstraps检验。对16S rDNA序列进行同样操作, 构建系统发育树。

3 结果与分析

3.1 菌株的分离纯化

在改良MRS培养基平皿中有两种菌落生长, 挑取典型菌落, 进一步分离菌株, 分别编号为1#、2#, 观察生长菌落特征及细胞形态(见图1、2、3及表1), 菌株1#、2#通过菌落形态特征及细胞形态特征均可区分, 初步判断菌株1#为目标菌株BB-12, 该菌株形态学符合双歧杆菌属特征描述。

3.2 Biolog全自动微生物鉴定系统对菌种的鉴定

Biolog全自动微生物鉴定系统给出的结果菌株

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BB-12为双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.), 为属水平鉴定结果。

3.3 基因组DNA提取、PCR扩增与序列测定

提取的基因组DNA片段大于23 kb, 满足PCR扩增的需求。用引物对atp-1和atp-2扩增atpD基因片段, 目的条带约为1.1 kb (图4)。用引物对27F和

图1 厌氧37C培养3 d菌落形态

Fig.1 Colony morphology on anaerobic 37C, 3 d

注: 菌株1#和菌株2#在添加了双氯青霉素、氯化锂和半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基上, 菌落大而乳白色的为双歧杆菌, 菌落小而半透明状的为链球菌.

Note: Strain 1# and Strain 2# on MRS with dicloxacillin, lithium chloride and cystein hydrochloride. Big, white colonies are Bifido-bacterium sp., small colonies are Streptococcus sp..

图2 菌株1#的细胞形态(× 1000)

Fig. 2 Micromorphology of strain 1# (× 1000)

图3 菌株2#的细胞形态(× 1000)

Fig. 3 Micromorphology of strain 2# (× 1000)

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1541R扩增16S rDNA序列, 目的条带约为1.5 kb (图5)。atpD基因序列在GenBank登录号为GU116482, 16S rDNA序列在GenBank登录号为GU116483。

表

1

分离菌株在改良MRS琼脂培养基的

菌落特征及细胞形态

Table 1 Morphology of strain 1# and 2# on

modified MRS agar

菌株编号

Strain 菌落形态

细胞形态 number

Colony morphology

Micromorphology

乳白色, 表面光滑, 中 革兰氏阳性, 菌体呈棒状, Y字1#

央隆起, 边缘整齐, 菌 形, 顶端膨大, (0.631.25) μm × 落直径约3 mm。 (3.126.25) μm。 2#

无色, 表面光滑, 边缘 革兰氏阳性, 菌体呈球状, 整齐, 菌落直径约1 mm。 形成长链, 直径约1 μm。

图4 菌株BB-12 atpD基因PCR扩增结果

Fig. 4 atpD gene PCR amplification result of strain BB-12

注: M: DL2000 marker; 1: 菌株BB-12. Note: M: DL2000 marker; 1: Strain BB-12.

图5 菌株BB-12 16S rDNA 序列PCR扩增结果

Fig. 5 16S rDNA sequences PCR amplification result of

strain BB-12

注: M: DL2000 marker; 1: 菌株BB-12. Note: M: DL2000 marker; 1: Strain BB-12.

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3.4 菌株系统发育树的构建和系统发育分析

以Escherichia coli ATCC 11775T为外群, 构建菌株BB-12 16S rDNA序列系统发育树(图6)。菌株BB-12与动物双歧杆菌的2个亚种B. animalis subsp. lactis DSM 10140T、B. animalis subsp. animalis JCM 1190T聚类在分类距离最近的一个分支上, Bootstrap支持率为100%, 菌株BB-12与B. animalis subsp. lactis DSM 10140T、B. animalis subsp. animalis JCM 1190T序列同源性均在99.1%以上, 与双歧杆菌属内其他种同源性均低于97%, 鉴定结论为动物双歧杆菌(B. animalis), 在种水平上有很好的分辨率。

以一组乳杆菌L. rhamnosus DSM 20021、L. gasseri DSM 20243、L. amylolyticus DSM 11614、L. acidophilus ATCC 4356、L. helveticus NCDO 2712为外群, 构建菌株BB-12 atpD基因系统发育树(图7)。菌株BB-12与B. animalis subsp. lactis DSM 10140T及其他多株B. animalis subsp. lactis聚类在分类距离最近的一个分支上, Bootstrap支持率为52%。菌株BB-12与B. animalis subsp. lactis DSM 10140T序列同源性为100%, 与B. animalis subsp. animalis ATCC 25527T同源性为97.2%, 与B. bifidum ATCC 29521同源性为96.1%, 与双歧杆菌属内其它种同源性均低于90%, 鉴定结论为动物双歧杆菌乳亚种

(B. animalis subsp. lactis), 在亚种水平上有很好的分辨率。

比较16S rDNA序列和atpD基因的系统发育分析结果, 两个区段得到具有一致拓扑结构的系统发育树, 但是, 基于同源性高于99.1%的16S rDNA序列分析, 无法将动物双歧乳亚种DSM 10140T和动物双歧动物亚种ATCC 25527T清楚分开, 而动物双歧乳亚种DSM 10140T和动物双歧动物亚种ATCC 25527T的atpD基因序列有28个核苷酸可替代, 碱基差异率达到2.8%, 可以将两者清楚分开。

4 讨论

在传统的乳酸菌培养基MRS上, 含复合菌的乳

产品中乳酸菌均可生长, 多种生长特点相近的乳酸菌通过简单的菌落形态和显微形态难以区分, 不便 于双歧杆菌的检出计数[12]。现有的双歧杆菌计数国 标(GB/T 4789.34-2008)[10], 需要将在BBL、PYG、TPY培养基上生长的多种菌株分别进行生理生化鉴

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图6 菌株BB-12与相关种的16S rDNA序列系统发育树

Fig. 6 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequence data for strain BB-12 and other species of the genus Bifidobacterium

注: 采用MEGA 3.1软件, 邻位连接法显示菌株BB-12与相关种的16S rDNA序列系统发育树, 进行1000次的相似度重复计算, 图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值, 图例为遗传距离. B.: Bifidobacterium; E.: Escherichia.

Note: A neighbor-joining tree showing the 16S rDNA phylogenetic position of strain BB-12 and the relatively species using the software MEGA 3.1, Bootstrap values greater than 50% are shown in 1000 replicates. Bar, 0.02% nucleotide substitutions per site. B.: Bifidobacterium; E.: Escherichia.

图7 菌株BB-12与相关种的atpD基因系统发育树

Fig. 7 Phylogenetic tree derived from atpD gene sequence data for strain BB-12 and other species of the genus Bifidobacterium

注: 采用MEGA 3.1软件, 邻位连接法显示菌株BB-12与相关种的atpD基因序列系统发育树, 进行1000次的相似度重复计算, 图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值, 图例为遗传距离.

Note: A neighbor-joining tree showing the atpD gene phylogenetic position of strain BB-12 and the relatively species using the software MEGA 3.1, Bootstrap values greater than 50% are shown in 1000 replicates. Bar, 0.05% nucleotide substitutions per site. B.: Bifidobacterium; E.: Escherichia; L.: Lactobacillus.

定及有机酸代谢产物测定, 确定双歧杆菌菌落后计数。国内学者针对此类问题做了一些相关的工作, 沈永才[17]等应用荧光定量PCR法对双歧杆菌属内6个种15株菌进行了测定, 表明该方法可正确定量样品中双歧杆菌的数量。居建华等[18]报道了一种新的双歧杆菌鉴别计数培养基, 依据大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶可特异性水解含半乳糖低聚糖的特

性, 在改良MRS培养基上加入5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D-半乳糖物质, 作为底物, 使双歧杆菌水解底物释放出吲哚, 产生颜色反应。本实验中, 在普通的MRS培养基基础上, 加入双氯青霉素钠盐、盐酸半胱氨酸、LiCl, 可一定程度抑制除双歧杆菌以外的其他乳酸菌生长, 降低培养环境中的溶解氧, 有利于双歧杆菌的生长, 虽然还是有部分链球菌同时生长,

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但可通过菌落形态及细胞形态观察加以区分。

Atp操纵子共有8个阅读框架, 相对应是一个7.3 kb的DNA片段。在双歧杆菌中atp操纵子的基因顺序为atpBEFHAGDC, 这与已知的其他细菌atp顺序是一致的[19], Atp操纵子编码F1-F0ATP酶, 它是由两个亚单位组成, 分别是膜外的F1部分和膜内的F0部分, 此酶是双歧杆菌在酸性条件下生长的必要元素, 它能使双歧杆菌适应不同pH的环境。Atp操纵子特别是atpD基因具有很高的稳定性和普遍性, 适合作为种系分类的分子标记[2021], 本实验的结果也表明atpD基因相比16S rDNA序列在动物双歧杆菌亚种水平鉴定上有更好的分辨率。

随着物种环境选择压力及自身的进化演变, 一些微生物在基因水平上会发生相应的改变, 依靠单基因对微生物鉴定有时就失去了精确性, 双歧杆菌种类繁多, 《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)中列出了33个种, 加上后续发表的新种, 因此对双歧杆菌的多基因分析就显得尤为重要[8]。

同样, 多相鉴定也应相互补充相互印证鉴定结论。本实验中, 菌株BB-12宏观及微观形态符合双歧杆菌属特征, Biolog鉴定系统给出双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)的结果, 16S rDNA序列分析得到动物双歧杆菌(B. ani-malis)种水平的结果, atpD基因分析得到动物双歧乳亚种(B. animalis subsp. lactis)亚种水平的结果, 多相鉴定技术手段与多基因分析间结果互相吻合。

参 考 文 献

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