[食品生物技术]
验 指 导 书
北京农学院食品科学系
张红星、徐文生编著
二0 0六年九月 《食品生物技术》 实
实验一 质粒DNA的小量制备
1．目的
学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2．原理
根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0∼12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
3．器材
超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
4．试剂
pET-his质粒载体菌,pMD18-T-NK载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
5．实验准备
氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200μL 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121°C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），70%乙醇（-20°C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121°C 30min）。
6．操作步骤
（1） 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。
（2） 从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌种和pMD-18T-NK的菌种（操作完后迅速把
菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37°C摇床中摇20h。
pET-his菌： 接种于5ml LB（Amp+）； pMD18-T菌：接种于2ml LB（Amp+）
（3） 取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留
沉淀备用。
pET-his菌： 3管（3×1.5ml）； pMD18-T菌：1管（1.5ml）
（4） 在沉淀中加入100μl 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等
待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）
（5） 加入200μl 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。
（6） 加入150μl 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。
（7） 15000rpm离心5min，小心吸取400μl 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将
白色沉淀物带入！），加入800μl 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。
（8） 15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500μl 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋
混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净
（9） 再加入500μl 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，
小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净
（10） 离心管倒置于37°C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎
看不见！）。
（11） pMD18-T加入30μl 无菌蒸馏水或TE缓冲液； 3管pET-his质粒中每管加入10μl蒸馏
水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在
管底。待电泳确认（见实验二）后再在pET-his质粒中加入1μl RNaes A。用记号笔标记
后放入冰箱中备用。
（12） 在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水
池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告
7．思考