种子顽拗性的形成机理及其保存技术
西北植物学报2004, 24(11) :2170—2176Acta Bot . Boreal . -Occident . Sin .
文章编号:1000-4025(2004) 11-2170-07
种子顽拗性的形成机理及其保存技术
唐安军, 龙春林, 刀志灵
(中国科学院昆明植物研究所, 昆明650204)
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X
摘 要:根据种子的脱水行为将种子分为正常性种子、顽拗性种子和中间性种子. 顽拗性种子在发育的末期不经历成熟脱水, 脱落时有相对高的含水量, 并且对低温和脱水干燥非常敏感. 在自然界, 顽拗性种子存在一个连续群, 即低度、中度和高度顽拗性种子, 其差异在于对脱水伤害的敏感程度. 影响种子顽拗性的因素, 既有种子本身的生理生化物质基础, 也有种子在母株上发育过程中所经受的外界环境的影响. 目前, 对种子脱水耐性的分子机制及其保存技术研究得较多. 本文综述了有关顽拗性种子研究的近期进展.
关键词:顽拗性种子; 脱水敏感性; 顽拗性连续群; 脱水耐性的分子机制; 保存技术中图分类号:Q945. 65 文献标识码:A
Molecular mechanisms and storage technologies of recalcitrant seeds
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T ANG An -jun , LONG Chun -lin , DAO Zhi -ling
(Kunm ing Ins titu te of Botany, Chinese Academy of Sciences , Kun ming 650204, China)
Abstract :Acco rding t o seed sto rag e behavio r , seeds can be categ or ized into o rt ho dox seeds , r ecalcit rant seeds and inter medi-ate seeds. Recalcitr ant seeds hav e no t mat ur ation dry ing at the end of seed dev elo pment. W hen shedding fr om their mot her tr ees, r ecalcitr ant seeds have hig her w ater co nt ent than or thodox seeds and are r ather sensitiv e t o lo w t emper ature and desic-ca tio n . T her e is a continuum o f seed recalcitra nce in nature , namely , lo w recalcitr ance , inter mediate recalcitr ance and high recalcitr ance , differ ence o f w hich is sensitiv ity degr ee t o dr ying. P hy siochemic substance of seeds a nd eco lo gical factor s of seed dev elo pment o n mot her trees impact ser io usly their sto ra ge behav io r. A t pr esent, studies on molecular mechanism of desiccation tolerance and their sto rag e t echnolog ies have being carr ying out pr ov erbially at home and o ver seas. R ecent ad-vances on recalcitr ant seeds w ere summed up in this paper .
recalcitrant seeds ; desiccation sensitivity ; continuum of seed recalcitr ance ; molecular mechanism
of desiccation tolerance; storag e technolo gies
Key words :
成熟脱水是种子发育的末端事件, 是种子在贮藏或者环境胁迫中存活、保证植物繁衍的适应性对策. Rober ts(1973) 根据种子的贮藏行为把种子分为正常性种子(o rtho do x seed) 和顽拗性种子(r ecalcitra nt seed) 两大类型[1]. 正常性种子在母株上经历成熟脱水, 种子脱落时含水量较低, 通常在干燥(可以脱水到1%~5%的含水量) 低温状态下可以长期贮藏; 中间性种子能忍耐一定程度的脱水, 但过低的含水量在低温时易受伤害; 顽拗性种子不经历成熟脱水, 种子脱落
时含水量相对较高, 在整个发育过程不耐脱水, 通常对低温敏感(不能在10℃以下保存) , 在适合正常性种子贮藏的条件下, 甚至将其贮藏在湿境中, 寿命仍很短[2~6, 12]. 如果顽拗性种子的含水量低于某一相对高的临界含水量时, 则种子的生活力全部丧失[7]. 但顽拗性种子耐脱水的程度在不同种类中有差异, 同一种类脱落时的含水量也有季节性的变化[8~9, 12~14].
目前, 正常性种子的发育、萌发以及贮藏等方面的研究
X 收稿日期:2004-01-14; 修改稿收到日期:2004-05-09
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目(KS CX2-SW -117) ; 国家科技部基础性工作专项重点项目(2001DE A10009) ; 云南省
自然科学基金(2001C0058M , 2001PY017) ; 国家自然科学基金(30170102)
) , , . ac. *
11期唐安军, 等:种子顽拗性的形成机理及其保存技术
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已比较深入; 而顽拗性种子的研究起步比较晚, 研究的广度和深度较之不够. Sun 提出的设想, 即把萌发的正常性种子作为模式来研究种子的顽拗性机理, 是很有创新意义的[10]. 在此设想的启发下, 国际上诸多学者对顽拗性种子的发育、萌发及贮藏等方面的理论问题进行了探索, 并取得了不少成果. 本文综述了顽拗性种子近期的研究进展.
27%, 贮藏于17℃以下时, 迅速失去发芽力; 其种子最适的贮藏条件是33%~35%的含水量, 17~30℃, 贮藏期至少为70d, 发芽力67%[20]. 宋学之等[18]在研究龙脑香科(Dipt ero -car paceae ) 的两种植物时发现, 坡垒(H op ea hainanensis ) 种子含水量为38. 2%时发芽力可达100%, 可是当含水量低于20%时, 种子发芽力丧失. 当青皮(V atica astr otr icha ) 种子含水量从41. 6%下降至31%时, 发芽力显著下降. 此外, 主要产自热带、亚热带的顽拗性种子适应高温、高湿的生长环境, 而不耐低温. 有些种类在零上低温就会出现冷害(chiling in-橡胶和芒果种子在湿藏中的jur y ). 娑罗双(Shorea r obusta ) 、冷害温度, 分别为5℃、10℃、15℃[17,19]. 荔枝(L itchi chinen -sis ) 、龙眼(D imocar p us longyan ) 、黄皮(Clausena lansium ) 和木菠萝的种子在15℃下湿藏, 有利于延长种子寿命, 而在5~10℃中出现冷害, 其中以5℃以下的伤害出现较早, 也较严重[19,20]. 刚采收的芒果种子, 含水量约为70%~75%, 当自然脱水6d 时, 种子的发芽率降至50%以下, 再继续脱水到第8天, 发芽率完全丧失. 荔枝、龙眼和黄皮种子对脱水也非常敏感, 在自然脱水过程中生活力迅速丧失[3, 17, 19, 20]. Ber -jak 报道, 海榄雌种子成熟时的含水量为63%, 当脱水至52%时, 生活力丧失[2, 3].
一般认为, 顽拗性种子的低温伤害与其不耐脱水密切相关, 脱水敏感性是顽拗性种子的显著特征.
1 种子的顽拗性及其生态分布
1. 1 种子的顽拗性与顽拗性种子
顽拗性(r ecalcit rance , 也称脱水敏感性) 是在一定的生境条件下, 种子在发育过程中获得的一种综合特性, 它指的是种子脱水的忍耐程度, 即顽拗性种子(r ecalcitrant seed) 在脱水后的活力或发芽力的变化情况, 其反面被称为脱水耐性(desiccatio n t olerance) [11].
Ro ber ts (1973) 把能以某种方式干燥且贮藏寿命随含水量下降而增加的种子, 称作正常性种子(or thodox seed ) ; 而
把不能用正常性种子的贮藏条件来贮藏的种子, 称为顽拗性种子[1]. 随着对顽拗性种子认识的不断深入, Hanso n [15]认为脱水敏感性的术语更能准确地描述顽拗性种子. Ber jak [6]等则根据种子是否经历脱落前的最后发育阶段, 用含水量变化的(poikilo hydro us ) 和含水量不变的(ho moiohy dr ous) 术语, 来分别描述正常性种子和顽拗性种子. 宋松泉和傅家瑞[21]认为上述概念都忽略了顽拗性种子脱落后的行为与脱落前的发育之间的相互关系, 而将:顽拗性种子F 定义为::在发育中期获得发芽能力, 不经历成熟脱水的发育阶段, 脱落后对脱水和低温敏感的种子F .
正常性种子与顽拗性种子在贮藏特性上是否具有质的差别呢? 早期的一些研究认为, 顽拗性种子与正常性种子在贮藏特性上具有质的差异; 而现在认为, 它们的差别不在于有无耐脱水与耐低温性, 而在于数量上的差别[1, 3, 5]. 换言之, 种子的脱水耐性是一种数量性状(quantitat ive featur e) [14].
1. 3 顽拗性种子连续群及其生态分布
在自然界中, 顽拗性种子有一个连续群. Far r ant 等[23]
根据种子对脱水敏感性的差异, 提出了种子顽拗性连续群(co nt inuum of seed r ecalcit rance ) 的概念, 他们将顽拗性种子分为低度、中度和高度顽拗性3种类型. 低度顽拗性种子能忍受相当量的水分丧失和较低的温度, 在没有加水时萌发缓慢, 通常具有较高的脱落酸(A BA ) 和类脱水素的合成, 一般分布于亚热带和温带地区, 如壳斗科(F ag acea e ) 栎属的板栗(Castanea mollissima ) 、棕榈科(Palmae) 的丝葵(W as hing -tonia f ilif er a ) ; 中度顽拗性种子为热带和亚热带分布, 能忍受中等程度的脱水和一定范围的温度, 如可可和三叶橡胶; 高度顽拗性种子通常是热带湿地分布, A BA 含量低, 缺乏类脱水素蛋白(dehydrin-like pr ot ein) , 仅能忍受少量的水分丧失, 而且对温度敏感, 在没有加水时萌发迅速, 如海榄雌[24]. 在自然条件下, 海榄雌种子脱落后进入潮湿的环境, 果皮迅速脱落, 在48h 内可见根的伸长[11, 25, 26].
1. 2 顽拗性种子的基本特性
产生顽拗性种子的植物主要有两大类型:(1) 水生植物, 如菱(T r a p a bisp inosa ) 、茭白(Ziz ania cad ucif lor a ) 等; (2) 具
大粒种子的多年生木本植物, 其中包括一些热带作物如可可(T heobr oma cacao ) 、橡胶(H ev ea brasiliensis ) 、椰子(Cocos nucif er a ) 等, 热带果树如芒果(M angif er a indica ) 、榴莲(D u -红毛丹(N ep helium la p p aceum ) 、木菠萝(A r -rio z ibethinus ) 、
tocar p us heter op hy llus ) 等, 热带林木如坡垒(H op ea haina -nensis ) 、青皮(V atica astrotr icha ) 等和温带植物如板栗(Cas -栎(Quer cus f ag inea ) 等[5, 7, 12, 16, 17]. 顽拗性tanea mollissima ) 、
种子通常不经历成熟脱水, 脱离母株时含水量相对较高, 一般在25%以上, 有的高达40%; 而且种子对脱水伤害的反应高度敏感. Ber jak 报道, 海榄雌(A v icennia marina ) 种子成熟时的含水量为63%, 当脱水至52%时, 生活力丧失[2, 8]. 根据Hanso n 的报道, 红毛丹种子的临界含水量约20%, 榴莲种, [. 2 顽拗性种子脱水敏感性的生理行为
2. 1 种子已进入萌动状态
Ber jak 等[25]提出, 顽拗性种子脱水敏感性可能是由于
在贮藏中萌发, 在这方面顽拗性种子类似于吸收水分、萌发的正常性种子. 为了检验这个假说, 证实顽拗性种子脱水敏感性的原因, F ar rant 等[2, 3]研究了海榄雌种子的贮藏行为, 并提出了解释顽拗性种子脱水敏感性的模型.
F ar rant 等[2, 3, 23, 26]提出, 当顽拗性种子刚脱落时, 尽管,
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细胞内的许多水分可能以自由水的状态存在. 如果迅速干燥, 大多数水分可散失, 而没有潜在的致死的细胞内紊乱. 随着萌发过程的进行, 细胞内各种代谢活动不断加强, 对于结构水-束缚水的需求愈来愈多, 种子对脱水变得非常敏感, 致死水分含量上升.
顽拗性种子通常体积较大, 含水量较高, 胚/胚乳的比例很小. 当缓慢脱水时, 在短期内萌发仍然不断进行, 直到低于临界含水量[23]. 甚至当整粒种子进行快速脱水时, 水分丧失仍相对缓慢, 胚或胚轴从胚乳和/或者子叶中吸收水分, 一些与萌发有关的代谢仍然能够进行. 快速干燥能使胚轴的含水量迅速降低, 从而抑制萌发过程的进行, 保持生活力.
锥栗成熟种子胚的超微结构中也发现类似现象. 这些都在一定程度上支持关于顽拗性种子脱水敏感性的观点. 板栗和锥栗的试验进一步提供了的证据, 这两类树种种子发芽快慢与脱落酸含量有关, 板栗种子中A BA 含量较高. 而且, 种子和芽对脱落酸含量的敏感性都较锥栗高. 从种子发育过程中A BA 含量的变化以及外源脱落酸对种子萌发的反应浓度, 可见在A BA 总浓度较大时可以抑制种子萌发; 而发育中期内源A BA 浓度较低, 要抑制萌发就需要较高的外源A BA . 在探讨这两种顽拗性种子保存时, 选择适当的采种时间进行A BA 处理, 可以有效地保存种子的生命力[34].
在种子发育过程中, A BA 对离体胚的贮藏蛋白质合成起到调控作用[34,35]. 从板栗和锥栗不同发育时期离体胚的培养发现, 随着胚成熟度增加, 完全抑制萌发所需的外加A BA 浓度增大. 板栗和锥栗种子在发育后期含水量较高, 胚内蛋白质合成仍以较高速度进行, 离体胚培养表明, 10-4m ol /L 浓度的A BA 可有效地增加胚内贮藏蛋白质的积累. 试验表明A BA 作为发育中离体胚培养时对蛋白质合成的调节作用, 是随着胚的发育阶段而改变的[36].
至于ABA 对贮藏蛋白质合成的促进作用是发生在转录水平, 还是发生在转录后水平或者翻译水平上, 意见仍不一致[34]. 红锥(Castanop sis hy str ix ) 和苦槠(Castanop sis scle -r op hylla ) 的种子是典型的顽拗性种子. 郑郁善[36]研究了A BA 对红锥和苦槠种子发育和萌发的效应, 他采用酶联免疫分析法(EL ISA ) 提取和测定红锥和苦槠发育过程中果实内A BA 含量, 并用不同浓度A BA 喂养, 测定果实不同发育时期对外源A BA 的敏感性, 还用放射性同位素法测定A BA 对贮藏蛋白质的积累作用. 结果表明:红锥和苦槠种子发育过程内源A BA 含量逐渐上升, 直到高峰期, 随后A BA 含量逐渐下降. 成熟时果实内ABA 含量比高峰时低8~9倍. 随着果实的发育, 种子对外加ABA 的敏感性逐渐变小, 外源A BA 浓度10-4mo l/L 完全可以抑制成熟前期的种子的发芽, 但对成熟种子, 10-2mo l /L A BA 亦不能抑制其萌发. A BA 对成熟前期贮藏蛋白质合成无影响, 但能促进成熟中后期胚的贮藏蛋白质的累积作用, A BA 维持红锥和苦槠贮藏蛋白质合成和积累作用表现在转录水平上.
2. 2 顽拗性种子的水分状态
有研究表明, 干燥种子的水分含量和水分状态对其耐脱水性发挥重要的作用. 正常性种子中束缚水(生命水) 一般不超过种子干重的10%, 由于通过离子键与大分子表面紧密结合, 几乎成为种子结构的一部分, 脱水时很难失去[28, 29]. 有人推测不耐脱水的种子可能是缺乏与大分子物质紧密结合的那部分水(或在干燥时不能保留) , 姜孝成等[29]用核磁共振法, 测定了几种正常性种子和顽拗性种子在脱水时水分状态的变化, 指出正常性种子中自由水和束缚水是完全分开的, 而顽拗性种子中水分基本上以单一状态存在(其依据是自由水和束缚水不能从核磁共振波谱峰形的变化区别开来, 而表现出与正常性种子中水分状况变化的本质区别) , 并认为通过测定种子中水分状态及其变化的差异可能作为判断种子类型的重要依据. 姜孝成等[28]以黄皮种子为材料研究表明, 黄皮种子的水分状态变化与其活力之间存在明显的相关性. F arr ant 等[23]认为, 随着顽拗性种子的萌动, 不可冻结水(亦称为生命水或束缚水) 的水平增加, 种子脱水敏感性也增加. 黄皮种子生理成熟后采收, 则持水能力增强, 不可冻结水的比例增加, 可以推测此时种子已经进入萌动状态. 此外, 一些学者[30]认为顽拗性种子胚轴中束缚水的含量和自由水的熔解热焓与其脱水敏感性之间有某种相关性, 但顽拗性种子中水分状况变化的原因及其机理至今尚不清楚.
2. 3 脱落酸(ABA ) 与顽拗性
脱落酸在种子发育、萌发和休眠等许多生理生化过程中起着重要作用[31~35]. 在通常情况下, 种子应在胚完全成熟后才萌发. 但将未成熟的胚从种子中分离出来置于培养基上培养, 胚即停止发育而转向萌发, 而在培养基中加A BA , 可以阻止胚的萌发促进其继续发育[34]. 在萌发的胚中, 贮藏蛋白质和一些种子特有蛋白质的合成停止, 当加入A BA 于培养基中, 贮藏蛋白质的合成和积累得以继续. A BA 抑制胚提前萌发和促进胚继续发育, 并能保持贮藏蛋白质基因表达的能力随胚成熟度不同而有差异[35].
根据试验可知, 板栗(Castanea mollissima ) 和锥栗(C . henry i ) 在成熟后一般不存在脱水休止期, 采收时含水量高达30%以上, 达到高峰后迅速下降. 种子发芽基本上不需外加水分[36]. 一些顽拗性种子成熟脱落时代谢较活跃, 即呼吸, . 2. 4 寡糖、LEA 蛋白与顽拗性
2. 4. 1 寡糖 水分代谢假说[38]认为, 在脱水过程中糖在大分子表面代替水分子, 使膜在脱水状态下保持稳定. 在成熟种子中, 高水平的糖(特别是蔗糖、棉子糖和水苏糖) 能够为脱水耐性的种子提供耐脱水的机制[39]. 已经证明未成熟玉米胚脱水耐性的获得与蔗糖和棉子糖的含量有关. 在高等植物中, 缺乏海藻糖, 蔗糖起代替水分子的作用. 胚轴中蔗糖的含量与种子的类型有关[37]. 顽拗性种类Scadox us 含有特别高的棉子糖, 在已测定的顽拗性种类的胚轴中缺乏水苏糖, 正常性种类含有高得多的水苏糖/蔗糖的比率. 从顽拗性和正常性种子的比较可以看出, 除了蔗糖的作用外, 棉子糖和水苏糖在高等植物的脱水耐性, 也可能在玻璃化作用下起着
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寡糖在脱水耐性中的另一个作用是形成玻璃化状态, 亚细胞溶液在低含水量和高糖水平时的玻璃化作用可能限制分子运动, 维持生化活性的静态平衡, 在干燥状态下保护亚细胞的稳定性. 尽管顽拗性种子含有大量和适当比例的寡糖, 但仍保持脱水敏感性. 在脱水敏感性种子中, 如果玻璃化状态的形成是可能的, 那么只可能在人工快速干燥的条件下发生[40, 41].
2. 4. 2 LEA 蛋白与顽拗性 脱水耐性的获得通常是在成熟脱水前及脱水过程中. 在种子发育过程中, 一组随时间变化的高度丰富的亲水性蛋白与种子的脱水耐性有关[63].
许多脱水耐性种子的研究表明, 在种子发育的后期, 一组脱水或A BA 诱导的亲水性蛋白(L EA 蛋白) 产生和积累
[41, 42]
galensis , S w ietenia macr op hy lla 3物种的种子表现为中间型种子贮藏行为. 这些种子表现出的差异, 在他们的分析中认为, 起决定性作用的因素是植物的生活环境[39]. 文彬等(2002) 的研究也表明了植物的生态环境很大程度上决定了种子的特性[48]. 由此可见, 研究种子的顽拗性必须研究其母株的自然生境, 才能全面地揭示种子顽拗性的本质.
4 顽拗性种子的保存
4. 1 短期保存
由于顽拗性种子不耐脱水及低温, 因此, 人们首先注意到的是在不影响种子活力的前提下, 尽可能降低种子贮藏温度及其含水量, 以降低种子贮藏过程中的代谢强度, 并添加杀菌剂保存种子, 从而达到短期贮藏的目的. 人们在研究顽拗性种子保存技术的过程中, 运用了多种方法, 如适温保湿贮藏法、控湿贮藏法和气调贮藏法等方法. 黄皮种子自然条件下的寿命只有10余天, 木菠萝种子寿命也只有一个多月, 但陆旺金等[50]将生理成熟期的新鲜种子部分脱水后加入4%~6%的百菌清装入塑料袋贮于15℃, 600d 后仍保持90%的发芽率. 唐林风等[51]将木菠萝种子先进行部分脱水至种皮趋于风干状态, 然后置于能适度换气的塑料袋中, 15℃下贮藏, 850d 后仍保持90%的发芽率. 当荔枝种子自然风干含水量降至33%时, 生活力在50%以下, 而脱水4d 后含水量降至21%~22%时, 完全丧失生活力, 与此同时, 在种子浸出液中的电导率、可溶糖及U V 吸收物质迅速增加, 可见细胞膜受到伤害(F u 等1990) [61]. Chin 等(1984) [62]曾报道龙眼种子贮于湿砂中17d, 可提高发芽率. 这也表明龙眼种子具有轻度休眠性. 山竹子(Garcinia mangostena ) 种子放入湿活性炭, 在21~29℃中贮藏保存, 可保持较高生活力达42d 以上(W inter s 和Ro dr ig uez-Co lo n, 1953) [63]. Chin (1980) [64]也肯定了用湿活性炭或泥炭土的效果, 可以保持生活力达6~8周. P ro bert 和L o ng ley (1989) [65]对3种水生植物(Ziz ania p alustr is 、P orteresia coar ctata 、Sp ar tina an -glica ) 的顽拗性种子进行控湿贮藏. 在不同的PEG 浓度环境中, Ziz ania p alustris 种子发芽率显著差异, 其中以98. 4%R H 为最佳, 其次是97. 7%RH, 而92. 4%RH 最差, 等等. 这些方法虽然大大延长了种子的寿命, 但从种质保存的角度而言仍不够, 主要是这种方法只能有限地延长种子的寿命, 且种子贮藏过程中活力仍不断下降.
, 其中一些蛋白可能通过与大分子结构结合, 涉及种
[43]
子脱水耐性的机制, 对幼苗脱水伤害起保护作用敏感性组织的固有特征的假说
[43]
. 海榄雌
种子不产生L EA 蛋白, 从而支持了LEA 蛋白的缺乏可能是
. 源于热带湿地的顽拗性
种子在发育过程中不形成L EA /脱水素蛋白. 温带的顽拗性种子虽然形成脱水素, 但转向萌发时脱水素的合成能力降低或不能合成, 这可能是它们脱离母体后活力丧失的重要原因[65]. L EA 蛋白的缺乏可能是由于相关基因的缺乏, 或者是由于相关基因转录成L EA 蛋白的能力丧失.
在幼苗组织中L EA 蛋白被A BA 和/或者脱水诱导, 认为在脱水胁迫过程中ABA 可能作为一种LEA 基因转录的信号转换器起作用
[43, 47]
. Finch-Sav ag e 研究了5种温带树生
产的脱水敏感性种子, 应用了免疫学方法, 测定结果表明:在这些成熟的种子中含有与脱水素(dehydrins ) 同源的蛋白[44]. 利用棉花cDN A 克隆(D 11) 发现在这些种子中存在L EA 蛋白的mR NA . 这种L EA 的mRN A 可被有限度的脱水和A BA 诱导
[44~47]
. L EA 蛋白在种子发育中的表达模式,
分布广泛, 保守的顺序结构, 高度的亲水性和抗变性的能力, 为其在脱水耐性中的重要作用提供了间接证据. 转基因实验则直接证明了L EA 蛋白的作用[59].
3 种子发育生态环境与顽拗性
产生顽拗性种子的植物, 通常存在于易于迅速形成幼苗的生态环境, 例如水体或者沼泽环境和潮湿的森林地带, 这些地方通常没有低温胁迫[3]. 在这些环境中, 种子在发育过程中无成熟脱水以及种子对脱水非常敏感的特性, 是长期适应其自然生境的结果. 顽拗性种子成熟脱落时, 植物没有赋予它像正常性种子那样能抵抗自然逆境的机制(如休眠、成熟脱水等) , 只是使种子包裹在高含水量的果肉或假种皮中(如热带水果荔枝与龙眼). 种子因含水量很高, 生理代谢活动旺盛, 所以只能湿藏(而且是短期的) , 干燥脱水或低湿贮藏都将不同程度地导致种子活力的下降. Hong 和Ellis (1998) 比较研究了楝科(M eliaceae) 6个不同物种的种子的贮藏行为, 发现A glaia car kii 和Sandor icum koetij a p e 的种子表现为顽拗性; 川楝(M elia az edar ach ) 的种子表现为正常型特; z 4. 2 超低温保存及其影响因素
4. 2. 1 超低温保存 由于在超低温中, 组织代谢趋于停止, 且不发生遗传变异, 能够长期保存种质. 因此, 超低温保存被认为是保存种质最有希望的途径[54, 59, 60]. 近年来, 人们对可可、椰子、橡胶、龙眼、栎属植物、栗、茶(Camellia sinensis ) 、油棕(Elaeis guineens is ) 、南洋杉(A r aucar ia cunning hamia ) 、咖啡(Cof f ea ar abica ) 、黄皮等多种顽拗性种子种质的超低温保存进行了探索性的研究. 但仍然未能取得突破性的进展. 对顽拗性种子超低温保存的研究还是初步性的, 具体应用还
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并不理想, 如欧洲栗虽然能产生根或茎, 但在培养的时间内均未能产生幼苗[51, 52]. 为了超低温贮藏, 提出了各种脱水技术, 如高浓度玻璃化、包埋脱水技术等, 防止在迅速脱水时产生结晶. 但直接玻璃化溶液可引起伤害, 因此提出了应用PV S2溶液控制脱水过程, 以及预先诱导提高脱水耐性. 巴西橡胶包埋经蔗糖预培养可提高脱水耐性与冷冻耐性[10]. 4. 2. 2 影响超低温保存的因素 影响超低温保存的因素很多, 如供试材料的类型、发育时期、脱水方法、含水量、冰冻保护剂的性能、降温速度、化冻方式、恢复生长培养基的种类以及生长调节剂的组分等因素都影响超低温保存后的恢复生长. 综合已有的研究成果, 认为顽拗性种子超低温保存以胚或胚轴为佳, 因为胚或胚轴体积小, 易于短时间内脱水而又不影响活力, 更为重要的是, 与种子的其它组织相比, 胚或胚轴的耐脱水及耐低温的能力强
[57~60]
剂的超低温保存过程中, 因为这样处理能够对保存材料进行低温锻炼, 提高存活率. 好的防冻剂组合能够降低保存材料的冰点温度, 缓和超低温保存冷冻伤害, 使其最佳含水量范围得到扩大.
5 结束语
关于脱水耐性的假说有:¹减少液泡化[8]; º水分代替假说[37, 41](w ater replacem ent hy pothesis ) ; »玻璃化作用[40,41]; ¼产生LEA 蛋白[26]. 事实上, 顽拗性种子在胚轴含有相当高的含水量时就丧失生活力, 所以水分代替假说不可能解释这种脱水敏感性. 同样, 玻璃化作用也不可能在顽拗性种子中自然形成. L EA 蛋白与脱水耐性有关, 其类似于幼苗对水分胁迫反应合成的蛋白质. 如果L EA 蛋白的缺乏被证明是顽拗性种子的特征, 那么种子脱水敏感性的主要原因可能是缺乏L EA 蛋白. 顽拗性种子的发育与脱水耐性的研究还远远落后于正常性种子的研究, 以萌发的正常性种子为模式来研究顽拗性种子, 是很有创新意义的.
目前, 国际上对顽拗性种子的研究十分重视, 脱水耐性的研究已是种子生理研究的热点之一, 研究工作主要集中在脱水过程中顽拗性种子的生理生化变化、贮藏条件对种子活力的影响以及保存技术等方面. 事实上, 还有很多方面的工作需要进行研究, 如顽拗性种子贮藏特性与自然生境的关系, 顽拗性种子的遗传本质, 顽拗性种子进化的分子机制等方面的问题都需要深层次的探索. 可以肯定的是A BA 、L EA 蛋白、糖等在种子脱水耐性的获得中具有重要作用. 可以预见, 脱水耐性的获得不仅仅是某种单一因子的作用, 而涉及到多种因素的复杂的作用过程. 特别地, 分子生物学研究方法的引进为顽拗性种子的研究注入了新的活力. 通过用生理生化的方法提高顽拗性种子的脱水耐性, 找到最佳的种质保存技术, 通过转基因技术使种子脱水敏感性变为脱水耐性, 将是一个需做大量研究工作而且具有十分诱人的前景.
. 大多数顽拗性种子超
[2]
低温保存均选用生理成熟期的胚或胚轴, 这主要由于顽拗性种子湿藏过程中易萌发, 因此新鲜的材料更为理想.
种子的超低温保存, 含水量高低以及脱水方法是关键因素
[2, 51~56]
. 含水量过高会造成保存材料在冷冻和解冻过程中
引起冻害甚至死亡, 过低又会造成脱水伤害影响其活力. 如能最大限度地减少脱水伤害和降低含水量, 保存材料的活力就能得到最大限度的保持. 正常性种子超低温保存的最适含水量一般在9%以下, 有的含水量下限值达到2%水量下限通常较高, 在10%以上
郑郁善等
[54]
[55, 57, 58]
[54]
, 仍能
保持较高的发芽, 然而, 大多数顽拗性种子的保存其最低含
.
研究了板栗的超低温保存, 发现板栗种子
在脱水过程中, 由于其脱水耐性差, 导致种子发芽率不断下降, 直至生命力丧失. 超低温保存后种子发芽率除了受种子含水量影响外, 还有冷冻方式, 各种解冻方式之间差异较少, 20%含水量+缓冻+缓解的组合能够得到较高的存活率(25%) ; 还发现在对板栗种子进行超低温保存时, 对材料进行低温预处理(0~5℃) 是必须的, 特别是在离体胚添加防冻
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