检验步骤(标准版)

1、鸡新城疫低毒力活疫苗（Lasota株）

1、安全检验

检验步骤：2~7日龄SPF鸡20只—→10只滴鼻免疫0.05ml（含10羽份）；10只不接种对照—→

同条件分别饲养10日，因无不良反应（如有非特异性死亡，免疫对照组均不得超过1只）

疫苗稀释：500羽/瓶—→加2.5ml生理盐水即可（200羽/ml即20羽/0.1ml即10羽/0.05ml）

2、效力检验

检验步骤：按瓶签注明羽份（500羽/瓶），用灭菌生理盐水将疫苗稀释至1羽/0.1ml—→再进行

10倍系列稀释—→取3个适宜稀释度分别尿囊腔（AS）接种10日龄SPF鸡胚5枚（共

15枚）每胚0.1 ml—→37℃继续孵育120h—→48h前弃去；48~120h内死亡鸡胚收获尿

囊液（同一稀释度等量混合）分别测定红细胞凝集价；120h活胚逐个测红细胞凝集价（微

量法不低于1:128者判为感染）—→计算EID50,每羽份病毒含量应≥106.0 EID50.

疫苗稀释：500羽/瓶—→加５ml生理盐水（100羽/ml）—→10倍稀释（10羽/ml即1羽/0.1ml）

—→再进行10倍系列稀释（一般取10-5、10-6、10-7）

3、鉴别检验

检验步骤：将疫苗用生理盐水稀释至105.0 EID50/0.1ml—→与等量抗鸡新城疫特异性血清混合—

→室温作用60min—→尿囊腔（AS）接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1 ml—→37℃

继续孵育120h—→24~120h内应不引起特异性死亡，且至少存活8枚；—→每枚鸡胚红

细胞凝试验应为阴性。

疫苗稀释：通过效力检验计算毒价，例如病毒含量为108.6 EID50/0.1ml要稀释至105.0 EID50/0.1ml，稀释103.6倍。

2、鸡新城疫中等毒力活疫苗（I系）

1、安全检验

检验步骤：2~8月龄健康易感鸡4只—→每只肌肉注射0.2ml？？？（含10个使用剂量）的疫苗

—→观察10~14日，允许有不良反应，但须在14日内恢复，疫苗判为合格。如有1

只鸡出现腿麻痹，不能恢复时，允许用8只鸡重检一次，重检结果如有1只鸡出现上

述同样反应，疫苗判为不合格。

疫苗稀释：500羽/瓶—→加５ml生理盐水（100羽/ml即20羽/0.2ml）—→再2倍稀释（10羽/0.2ml）

2、效力检验

检验步骤：按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水将疫苗稀释至1羽/0.1ml—→再进行10倍系列稀释

—→取3个适宜稀释度（如10-4、10-5、10-6）分别尿囊腔（AS）接种10日龄SPF鸡胚5

枚（共15枚）每胚0.1 ml—→37℃继续孵育24~72h—→记录鸡胚死亡情况，死亡胎儿应

有明显病痕。—→同一稀释度的死胚胚液等量混合，测定血凝价，［微量法不低于（1:64）

~（1:512）判为感染］—→计算EID50，每羽份病毒含量应≥105.0 EID50。

疫苗稀释：500羽/瓶—→加５ml生理盐水（100羽/ml）—→10倍稀释（10羽/ml即1羽/0.1ml）

—→再进行10倍系列稀释（一般取10-5、10-6、10-7）

3、鉴别检验

检验步骤：用灭菌生理盐水将疫苗稀释至103.0 EL D50？？？50/0.1ml—→与等量抗鸡新城疫特异

性血清混合—→室温作用60min—→尿囊腔（AS）接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1

ml—→37℃继续孵育120h—→24~120h内应不引起特异性死亡，且至少健活8枚；—→

每枚鸡胚红细胞凝试验应为阴性。

疫苗稀释：通过效力检验计算毒价，

3、鸡痘活疫苗

1、安全检验

检验步骤：1~14日龄SPF鸡10只—→各肌肉注射0.2 ml（含10羽份）—→观察10日应全部健活

疫苗稀释：500羽/瓶—→加５ml生理盐水（100羽/ml）—→2倍稀释（50羽/ml即10羽/0.2ml）

2、效力检验

检验步骤：按瓶签注明羽份，将疫苗用生理盐水稀释至1羽/0.2ml—→再进行10倍系列稀释—→

取3个适宜稀释度经绒毛尿囊膜（CAM）分别接种11~12日龄SPF鸡胚5枚（共15枚）

每胚0.2 ml—→37℃继续孵育96~120h—→鸡胚绒毛尿囊膜水肿增厚或出现豆斑判为感

染—→计算EID50,每羽份病毒含量应≥103.0 EID50.

疫苗稀释：500羽/瓶—→加５ml生理盐水（100羽/ml）—→10倍稀释（10羽/ml即1羽/0.1ml）

—→2倍稀释（5羽/ml即1羽/0.2ml）—→再进行10倍系列稀释（一般取10-2、10-3、10-4）

NDV鸡新城疫病毒 FPV鸡痘病毒 IBV鸡传染性支气管炎病毒 IBDV鸡传染性法氏囊病毒 ILT鸡传染性喉气管炎病毒

4、猪多杀性巴士杆菌病活疫苗

1、安全检验

（1）小鼠检验：

检验步骤：18~22克小白鼠5只—→皮下注射0.2 ml（含1/ 30头份）—→观察10日应全部健活 疫苗稀释：50头份/瓶—→加５ml生理盐水（10头份/ml）—→１０倍稀释（1头份/ml）—→6

倍稀释（1/6头份/ml即1/ 30头份/0.2 ml）

（2）豚鼠检验

检验步骤：300~400克豚鼠2只—→皮下注射2ml（含15头份）—→观察10日应全部健活

疫苗稀释：50头份/瓶—→加５ml生理盐水（10头份/ml）—→取3ml（10头份/ml 即30头份/3ml）

加1ml生理盐水—→30头份/4ml即（15头份/2ml）

2、效力检验

检验步骤：16~18克小鼠16只—→10只皮下注射0.2 ml（含1/ 150头份）；对照6只—→14日后

10免疫和3只对照各皮下注射C44-1株强毒液30~40MLD；另3只对照注射1MLD

—→观察10日：注射30~40MLD的对照组小鼠应全部死亡；注射1MLD的对照组小

鼠应至少死亡2只；免疫组小鼠应至少保护8只。

疫苗稀释：50头份/瓶—→加５ml生理盐水（10头份/ml）—→１０倍稀释（1头份/ml）—→１

０倍稀释（1/ 10头份/ml即1/ 100头份/0.1ml即1/ 50头份/0.2ml）—→3倍稀释（1/ 30

头份/ml 即1/ 150头份/0.2 ml）

5、鱼病多联抗体苗

一、种毒检验

1、无菌检验

2、蛋白含量测定

三、注意事项：

1、酶条有8孔和12孔两种规格

2、移液器用完后调至最大量程存放

二、半成品检验

1、无菌检验

2、浓度检验（ELISA

三、成品检验

1、物理性状。2、无菌检验。5、剩余水分。

3、安全检验：

检验步骤：5~7克，4~5月龄200尾 —→100尾腹腔注射10倍剂量；100尾不接种作对照 —

→观察30日应全部健活，若有非特异性死亡，应不超过10尾，且接种组不得超过对照

组。

注：1.接种量10倍剂量

4、效力检验： 定量分析法：至少应为69ug/ml）

检验步骤：5~7克，4~5月龄200尾 —→ 60尾腹腔注射免疫；60尾浸泡免疫—→30日后分

组攻毒 ：

取未免疫的30尾做对照和腹腔注射免疫的60尾分3组（每组30尾：注射免疫的20尾，未免疫的对照10尾）；取未免疫的30尾做对照和浸泡免疫的60尾分3组（每组30尾：浸泡免疫的20尾，未免疫的对照10尾）—→每种免疫方式分成的3个组，分别腹腔注射攻3种毒，每尾0.1ml(含5个LD50) —→观察7日，—→结果判定：对照组应至少死亡70%；注射免疫组保护率至少应为60%；浸泡免疫组至少30%

疫苗稀释：

四、不完全佐剂检验

（羊毛脂:石蜡油=1:9）

1、性状检测：不完全佐剂为淡黄色清亮液体。

2、无菌检验

3、安全检验：取体重5~7g、4~5月龄牙鲆鱼40尾，20尾腹腔注射50ul不完全佐剂；20尾不接种

作对照，同条件饲养，观察30日，应全部存活。若有非特异死亡应不超过2尾，且接种组非特异性死亡不得超过对照组。

五、用法用量

1、注射型疫苗

用生理盐水将每一瓶内疫苗稀释到25ml —→再与25ml的不完全佐剂等量混合均匀—→用1ml注射器进行腹腔注射接种（50ul/尾，含疫苗量3.75ug）。

2、浸泡型疫苗

用生理盐水将药盒内3只瓶内的疫苗溶解混合后，倒入装有90升海水的容器内充分搅匀，—→将1000尾5~7g、4~5月龄的幼鱼分2~3批放入其中浸泡，每批30min。每尾鱼的疫苗量为11.25ug。（接种浸泡前，应停食至少24h，浸泡时向海水内充气。海水温度在15~20℃为好。）

六、贮藏与有效期：-25℃一下保存，有效期11个月。

蛋白含量测定:

LD50

6、鸡球虫病三价活苗

一、半成品

毒力返强试验

检验步骤：将致弱处理的三种卵囊和一强毒株分别接种3日龄雏公鸡各10羽（每羽8000个卵囊）共40羽—→接种6~7天后分别收取卵囊—→再将此卵囊接种3日龄雏公鸡各10羽（每羽8000个卵囊）—→照此方法连续传5代。强毒株对照组也以同样方法连续传5代。—→第5代接种4~7天

后，剖杀所有试验鸡只，—→观察粪便和判定盲肠与小肠病变，—→结果判定：强毒组血便记分为+++~++++，强毒组病变记分为+3.5~+4分；致弱组粪便记分不超过+，病变记分≤+1分，判为合格。

二、成品

1、安全检验

检验步骤：将3日龄健康无球虫感染的雏鸡30羽分3组（10羽/组）—→分别用10倍和100倍使用剂量免疫其中2组，1组不接种作对照。—→结果判定：观察4~7天后，10倍量免疫组粪便记分为+，盲肠、小肠等部位病变记分在+1以下；100倍量免疫组无死亡，粪便记分为+~++，盲肠、小肠等部位病变记分在+2~+3，对照组无任何肉眼可见病变，疫苗判为合格。

2、效力检验

检验步骤：将3日龄健康无球虫感染的雏鸡40羽分2组（20羽/组）—→按免疫程序进行免疫，另20羽不免疫作对照。—→在第3次免疫后7天用9×104个强毒卵囊/羽（含三种球虫各3×104个强毒卵囊/羽）攻击两组鸡。—→结果判定：观察4~7天后，对照组粪便记分为++++，病变记分为+4分，死亡率在50%以上；免疫组无血便，无死亡，病变记分在+1以下，疫苗判为合格。

3、同笼试验

检验步骤：将3日龄健康无球虫感染的雏鸡20羽分2组（10羽/组）—→1组按免疫程序进行免疫，另1组不免疫（做标记）。—→两组鸡一起平养，至第3次免疫后的4~7天，观察试验鸡粪便并剖杀所有试验鸡，观察肠道病变。—→结果判定：所有试验鸡（含未免疫鸡）应无血便（+），盲肠、小肠病变记分均应在+1分以下，疫苗判为合格。

◆支原体检验

一、培养基

1、检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗 用改良Frey氏培养基。

2、检验其他种类细胞和病毒疫苗 用支原体培养基。

3、检验血清 用无血清支原体培养基。

二、检查法

1、样品处理

每批样品取5瓶。液体制品混合后备用；冻干制品，则加液体培养基（）或生理盐水复原成混悬液后混合。检测血清时，用血清直接接种到不含血清的培养基内。

2、培养基准备

2.1 液体培养基 将冷冻保存的液体培养基融化，分装到小瓶（100ml瓶），20ml/瓶；小管

（1.0cm×10cm），1.8ml/支。

2.2 固体培养基 将固体培养基加热溶解，温度降至60℃左右时添加辅助液（添加时轻轻摇

动，以免出现气泡）；按平皿规格（Ø90）倒入适量培养基。

2.3 培养基需要量

每批样品需要用培养基：小瓶1个（液体）；小试管2支（液体），平皿2付（固体）。 阳性对照需要用培养基：小瓶1个（液体）；小试管2支（液体），平皿2付（固体）。 阴性对照需要用培养基：小瓶1个（液体）；小试管2支（液体），平皿2付（固体）。

3、对照

阳性对照 禽类疫苗用滑液支原体，其它疫苗用猪鼻支原体做阳性对照。

阴性对照 用同批培养基作阴性对照。

4、疫苗检测

（1）接种与观察

取5ml疫苗混合物接种于装有20ml液体培养基的小瓶，摇匀后，再从小瓶中取0.8ml移植到2支小管液体培养基（0.2ml/支）；2付固体培养基（0.1~0.2ml/付）。液体培养物（小瓶与小管）置37℃培养，固体培养物（平皿）置含5%CO2培养箱培养。每日观察培养物有无颜色变化

（变黄或变红），观察14日。

分别于接种后5日、10日、15日从小瓶中取0.8ml培养物移植到2支小管液体培养基（0.2ml/支）；2付固体培养基（0.1~0.2ml/付）。每次移植培养物均观察14日。

在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管液体培养物颜色出现明显变化，即pH值变化

达±0.5时，应立即移植于小管液体培养基2支和固体培养基2付。观察移植的液体培养基是否出现恒定的pH值变化；固体培养基培养3天后在40—100倍显微镜下观察有无典型的“煎蛋”状支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落者时，停止观察。

每次移植培养必须设阳性和阴性对照，在相同条件下培养观察。阳性对照：禽类疫苗用滑液支原体，其它疫苗用猪鼻支原体做阳性对照。阴性对照：用同批培养基作阴性对照。

5、血清的检测

取被检血清10ml接种90ml的无血清支原体培养基，培养基按

6、检验操作示意图

样品3~5ml

↓

20ml/瓶→0.2ml/小管 → 14天

↓ 0.1~0.2 ml/平皿

5天 →0.2ml/小管 → 14天

↓ 0.1~0.2 ml/平皿

10天→0.2ml/小管 → 14天

↓ 0.1~0.2 ml/平皿

15天→0.2ml/小管 → 14天

0.1~0.2 ml/平皿

三、结果判定

1、阳性对照至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。

2、接种样品的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落，液体培养基pH值发生变化时，判疫苗或血清不合格。

（液体培养物：如有支原体污染，液体培养基因支原体生长变为淡黄色并浑浊。注意：被检物接种到液体培养基后，由于疫苗中保护剂的作用，经培养后，有时颜色发生变化，变淡发黄，但不浑浊，培养物透明，属于正常变化。在不能判断的情况下，进行移植培养，观察培养物是否出现恒定pH变化。

固体培养物：支原体在固体培养基上生长稍迟缓，接种3~7天后出现菌落，菌落非常小，直径在50~100um之间，用40倍左右显微镜观察，支原体菌落深入到琼脂面下生长发育，菌落中心侵进培养基深层，密集生长繁殖，在琼脂培养基的表面其边缘呈圆形，因此，菌落整体形态如油煎蛋状。注意：生物制品中污染的支原体，菌落并不像书上描述的典型菌落，而是呈圆形隆起，表面呈颗粒状，中心聚集如杨梅状，无外晕。只有经过多次传代后才能形成典型“油煎蛋”状菌落。）

四、注意事项

1、支原体检验要求的条件非常苛刻，所用器物必须清洁灭菌。

2、检验操作时必须戴口罩；工作帽；穿洁净工作服，操作中尽量不说话，不来回走动。

3、操作时绝对禁止用口吹吸管；口腔是口腔支原体感染的主要途径。

4、检验结束后，开封的检品要经灭菌后再处理。

◆外源病毒检验

一、样品处理

1、种毒：

鸡新城疫低毒力(LaSota) 种毒:种毒病毒含量/外源病毒检验时要求的含量（一般为10羽份/0.1ml）=该种毒的稀释倍数—→与等量抗血清中和

鸡痘种毒：

球虫种毒：

2、成品：

鸡新城疫低毒力活疫苗：取样3瓶（500羽/瓶）—→每瓶加M199溶液5 ml（100羽/ml即10羽/0.1ml）

—→各瓶取样2ml混合（共6ml）—→取混合样2.5ml与2.5ml抗血清等量中和（37℃中和1h其间摇数次）

鸡痘活疫苗：取样3瓶（500羽/瓶）—→每瓶加？？？5 ml（100羽/ml即10羽/0.1ml）—→混合样

品冷冻离心（4℃,1200g,15min）—→取上清液经0.8um、0.45um、0.22um、0.1um滤器各过滤1次

鸡球虫病三价活疫苗：取样3瓶（500羽/瓶）—→混合样品冷冻离心（4℃,12000g,15min）—→取

上清液经0.8um、0.45um、0.22um、0.1um滤器各过滤1次—→用M199溶液稀释至10羽/ml

二、接种、观察及判定

1、鸡胚检查法：

10日龄SPF鸡胚20枚—→10枚尿囊腔(AS)，10枚尿囊膜(CAM)接种0.2 ml/胚—→37℃继续孵育，观察7日—→弃去24h内死胚（但每组须活8/10以上实验成立）—→结果：胎儿应发育正常，绒毛尿囊莫无病变；鸡胚液血凝试验应为阴性

2、细胞检查法：

6瓶长成良好单层的细胞瓶（100 ml容量瓶）—→2瓶接种已处理的样品0.2ml/瓶37℃吸附1h换上维持液（含2~5%犊牛血清的乳汉液）；2瓶接LaSota病毒（104 EID50/瓶）；2瓶不接种作阴性对照—→37℃继续培养5~7天，每天观察应无任何CPE—→培养结束后，弃去培养液，用PBS( )轻洗细胞面3次—→每瓶细胞加0.1%（V/V）鸡红细胞液0.5 ml覆盖细胞面—→4℃放置1h—→再用PBS轻洗细胞面2次—→普通显微镜下观察：阳性对照应有典型红细胞吸附现象；阴性对照应无血球吸附现象；样品细胞不应出现红细胞吸附现象。

◆鸡胚成纤维细胞（CEF）单层的制备

10日龄SPF鸡胚—→无菌取出鸡胚于烧杯中—→去除头、四肢和内脏—→汉氏液洗涤胚体—→剪碎成米粒大小—→汉氏液洗涤2~3次—→加0.25%胰酶溶液（约4.0ml/胚）—→置38℃水浴消化20~30min—→吸出胰酶溶液，用汉氏液洗涤2~3次—→弃去汉氏液，加适量营养液（含5%犊牛血清的乳汉液，适量抗生素，一般500IU/ml）吹打成细胞悬液—→用多层（4~8）纱布（或80~100目尼龙网）滤过—→制成100~150万个/ml的活细胞悬液（一般估算不计数）—→分装到100ml细胞瓶中（10~15 ml/瓶），37℃CO2培养箱（瓶口要稍微拧松，便于CO2进入细胞瓶）或恒温培养箱—→24h后形成单层细胞备用。

◆禽白血病病毒（RAV）检验

一、样品处理

1、种毒：

2、成品：

鸡新城疫低毒力活疫苗：取样1瓶（500羽/瓶）—→加不含血清的M199溶液2ml（250羽/ml即200羽/0.8ml）—→取0.8ml（含200羽份）与0.8mlNDV抗血清等量中和（37℃中和1h其间摇数次）—→全部接种到细胞瓶中

问题：要不要离心取上清液后再中和

鸡痘活疫苗：取样2瓶（500羽/瓶）—→加不含血清的M199溶液2ml/瓶（250羽/ml即500羽/2ml）—→混合样品冷冻离心（4℃,12000g,15min）—→取上清液经0.8um、0.45um、0.22um和0.1um滤器各过滤1次—→取滤液2ml（相当于500羽份）用于接种CEF

冷冻离心（4℃,12000g,15min）？？？

球虫苗：

3、细胞液：

二、接种与培养

CPE接种后，37℃吸附1h—→弃去接种液，加生长液（含5~10%犊牛血清的乳汉液）—→次日换成维持液（含2~5%犊牛血清的乳汉液）

注：同时设立正常细胞作阴性对照；禽白血病病毒（RAV）作阳性对照。

阳性对照：对照分两组，每组2瓶CEF，弃去生长液（保留1 ml原培养液）—→两组对照分别加入RAV1和RAV2各0.5 ml—→37℃吸附1h—→直接加入培养液（？？？）（不用弃去原来液）—→同样品连传3代（传代时病毒对照要在最后进行）

试剂盒生产厂家，操作方法等

三、细胞传代与处理

待细胞培养5~7日后—→弃去细胞瓶中的液体，加适量胰酶EDTA消化液—→室温静置2~5min至

细胞松散—→弃细胞消化液，静置2min—→加入适量营养液（ ）使细胞悬浮—→将1/2细胞收集到试管中标记P1放-70℃—→另外1/2细胞分散到两个25ml容量细胞瓶中，加入培养液使之混匀—→同样培养至5~7日继续传代处理为P2和P3代，所有对照细胞瓶同样传代，阳性病毒对照应最后处理

四：结果判定（ELISA试验）

1、样品处理

将收获的细胞培养物冻融3次—→3000rpm离心5min—→取上清液作被检样品

2、试验操作

将试剂盒中所有成份回复到室温—→加样：每孔100ul被检样品，设阳性、阴性对照孔，每个样品加两孔，—→密闭（用封口膜封板）放置37℃作用1h—→洗涤：弃去样品，每孔加300ul洗涤液，放置1min，弃去洗涤液（含0.1%吐温-20的PBS即PBS-T）洗4~5次300ul/次，每次洗板要尽量弃尽洗涤液—→加酶标抗体：每孔100ul，密闭（用封口膜封板）放置37℃作用1h—→洗涤：同上—→加显色液：将试剂盒中的A液和B液等体积混合均匀后，每孔加100ul室温避光10min—→加终止液：每孔加100ul—→读数：用酶标仪在650nm波长下读取OD值（置酶联读数仪测定各孔OD650nm值）—→结果判断：当阴性对照OD650nm值小于0.2，阳性对照OD650nm值大于0.4时试验结果成立；被检样品OD650nm值大于0.3判为阳性，0.2≤OD650nm值≤0.3判为可疑，OD650nm值小于0.2判为阴性。对可疑样品应进行重检，重检仍为可疑判为阴性。

注意事项：1 试验过程中使用的吸头、容器等均要保证清洁；2 加终止液后尽快读数；3 每次的弃液应经无害化处理（???）。

◆禽网状内皮组织增生症病毒（REV）检验

一、样品处理

样品处理同禽白血病病毒检验法。

二、接种与培养

处理好的样品接种1个25cm2左右的CEF单层—→置37℃吸附1h—→弃去接种液，用含3%牛血清的M-199培养液洗CEF单层2次（2ml/次）—→每瓶细胞加7~8ml含3%牛血清的M-199培养液，37℃培养7日。

同时设立正常细胞作阴性对照；将鸡禽网状内皮组织增生症病毒（REV）至10TCID50/ml，取1.0ml接种至CEF作为阳性对照。

稀释10TCID50/ml

三、细胞培养的传代及处理

1、含鸡痘病毒（FPV）的制品

a、第一代培养物的处理

第一代检品培养物、病毒对照培养物及细胞对照培养物的细胞培养液，均无菌弃去2~3ml，使细胞培养瓶中剩余5ml然后将细胞瓶中的CEF单层及细胞培养液冻融3次，充分吹吸使细胞脱壁。细胞悬液于4℃,5000g离心10min，取上清液经0.1um滤膜过滤1次，滤液用于下一步检验。 b、接种CEF细胞

取上述处理好的样品滤液0.4ml用于接种已长成良好CEF单层的48孔细胞培养板，每个样品接种4孔，每孔0.1ml。剩余滤液全部接种于1个已长成良好CEF单层的细胞培养瓶中，37℃吸附1h。然后48孔板中每孔补加0.4ml含2%牛血清的M-199细胞培养液，细胞瓶弃去吸附液，每瓶加7~8ml含2%牛血清的M-199细胞培养液。细胞培养板接种后置5%CO2、37℃继续培养5天，然后进行荧光染色。细胞培养瓶接种后置37℃继续培养7天。

c、细胞传代

当接种的细胞培养板经荧光染色，判定为REV检测阳性时，细胞培养瓶培养物不必继续传代，否则按（2、其他制品及细胞液）方法传代

2、其他制品及细胞液

细胞培养7日后，按常规方法消化、收获细胞，将其中1/10的细胞用2ml含3%牛血清的M-199细胞培养液悬浮，接种4孔48孔板，每孔接种0.5ml。剩余细胞作好标记置-15℃保存备用。接种细胞的48孔板置5%CO2、37℃继续培养5日，然后进行荧光染色。

四、荧光染色

1、固定 弃去48孔板的细胞培养液，每孔约加0.5mlPBS（pH7.2下同）轻洗细胞表面1次，尽量

弃尽PBS，然后每孔加入0.3ml冷甲醇，置室温固定10~15min，弃去甲醇，自然晾干

（2~5min）。

2、加鸡抗REV单特异性抗体 自然晾干后，用PBS（pH7.2）洗细胞面1次，然后每孔加入0.1ml

用PBS（pH7.2~7.4）进行适当稀释的鸡REV特异性抗体，置37℃作用1h。

3、洗涤 弃去鸡抗REV特异性抗体，先用含0.05%吐温-20的PBS（pH7.2）洗3次，每次每孔加

入洗液0.5ml，轻微振荡洗涤1min。然后用PBS（pH7.2）以同样的方法洗2次。

4、荧光二抗染色 尽量弃尽洗液，每孔加入0.1ml用PBS（pH7.2）进行适当稀释的FITC标记的

兔抗鸡IgG，置37℃作用1h。

5、洗涤 同3。

五、观察

在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光（波长490nm）观察。染色后立即观察效果最好，在湿盒中

4℃避光保存1周内观察。

被感染的CEF细胞（典型的成梭状，但多数呈不规则型）呈绿色荧光，有完整的细胞形态，周围未被感染的细胞不着色，视野发暗。放大到200~400时，可见被感染细胞胞浆着色，细胞核不着色，胞核的位置相对较暗。

六、结果判定

1、当阳性对照接种的4个孔中全部出现特异性绿色荧光，阴性对照接种孔均未出现特异性绿色荧光时，检验结果成立；否则检验结果不成立，需要重新检验。

2、被检样品接种的4个孔中，只要有1孔出现特异性绿色荧光，即判定该样品中REV阳性，样品

外源病毒检验结果判为不符合规定。