小鼠胚胎冷冻方案
药品器材清单
PMSG 孕马血清促性腺激素
hCG 人绒毛膜促性腺激素
DPBS 杜氏磷酸缓冲液
M16 体外培养液
EG 乙二醇
蔗糖
塑料细管
1ml 注射器
35mm 培养皿若干
二氧化碳培养箱
小鼠胚胎的获取
控光（14h 光照，10h 黑暗）饲养1-2周后的4-6周龄小白雌鼠，腹腔注射10 IU/只PMSG ，48h 后腹腔注射10 IU/只hCG 。注射hCG 后（计时为0h ）当晚与雄鼠（≥8周龄）合笼（雌：雄=2:1或1:1）。次日早晨检查阴道栓，见栓雌鼠于72-82h 颈椎脱臼处死，采集桑椹胚。在DPBS 中洗净后移入M16培养基，置于5 %CO2,95 %空气, 相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中待用。
小鼠胚胎的玻璃化冷冻
平衡液 EG10，见附录溶液的配制。
玻璃化溶液 EFS40 ，见附表2。或者EG40，亦见附录溶液的配制。
解冻稀释液 用DPBS 稀释而成的0. 5mol/L蔗糖溶液。
将室温调至25℃, 经1～2小时将溶液及用具充分平衡后，用0. 25ml的塑料细管(Flance) 按顺序吸入解冻稀释液5cm ———空气1㎝——1.5cm 玻璃化溶液。
用吸管将胚胎移入平衡液平衡5分钟, 而后导入细管内的玻璃化溶液中平衡30秒。这30秒接着吸入空气1cm ——吸满解冻稀释液，封口后直接投入液氮中保存。
小鼠冷冻胚胎的解冻
将冻好保存于液氮中的细管, 取出后直接投入25℃水中快速解冻。当解冻稀释液部分由乳白变为透明时取出, 用吸水纸将细管水珠拭净, 剪断细管两端的栓塞后, 用含有解冻稀释液(0. 8ml) 的注射器 (带16号针头), 将细管内容物冲洗于表面皿中，轻轻摇匀, 置于实体显微镜下回收胚胎。回收的胚胎于解冻稀释液中平衡5分钟, 以便脱出细胞内部乙二醇, 再用PBS 洗净后, 移入M16溶液中于5 %CO2,95 %空气, 相对湿度100 %的二氧化碳培养箱中培养。 小鼠胚胎的发育能力判定
体外培养 回收的胚胎在M16中培养48小时以内恢复到囊胚或继续发育的胚胎视为有发育能力胚胎。
胚胎移植 解冻后的胚胎, 约经3小时培养, 选择外形良好的胚胎移植于与结扎输精管的公鼠交配后即假妊娠第3天受体鼠的子宫中, 一侧5～7枚, 每只受体10～14枚胚胎为宜。妊娠 19～22天观察产仔情况。