真菌几丁质合酶的研究进展
微生物学通报 FEB 20, 2008, 35(2):267~271 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS
真菌几丁质合酶的研究进展
冯贻安 崔志峰*
(浙江工业大学生物与环境工程学院 杭州 310032)
摘 要: 真菌细胞壁几丁质的合成是一个复杂的过程, 其关键酶为几丁质合酶(CS)。近年来, 丝 状真菌中的CS 研究有了大的突破, 与酿酒酵母中只有3种CS 不同, 丝状真菌中存在7种类别的CS 。大部分临床和农业中重要的病原真菌都是丝状真菌, 文中对真菌中7种类别CS 的结构和功能作了概述, 重点讨论了丝状真菌中重要的CS 类别, 并介绍了CS 作为抗真菌药物有效靶标的研究现状, 旨在为研究真菌CS 及其抑制剂提供参考。 关键词: 真菌细胞壁, 几丁质合酶, 基因敲除, 感染性
Progress in the Studies of Fungal Chitin Synthases
FENG Yi-An CUI Zhi-Feng*
(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032)
Abstract: Chitin is one of the most important component in fungal cell wall. Biosynthesis of chitin is a complex processes and needs several chitin synthase isoenzymes. The knowledge of structure, function and regulation of chitin synthases is mainly derived from the study of Saccharomyces cerevisiae. In contrast with the 3 chitin synthases in S. cerevisiae, 7 were found in most filamentous fungi. In this re-view the classification and function of chitin synthases are summerized, and progress in the studies on chitin synthases of filamentous fungi which are of theoretical or medical or agricultural importance, in-cluding Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus and Ustilago maydis are emphasized. Recent ad-vance of research on chitin synthase as antifungal target is also discussed. Keywords: Fungal cell wall, Chitin synthase, Gene disruption, Virulence真菌细胞壁是真菌细胞外的重要结构, 主要由葡聚糖, 甘露聚糖和几丁质等组成, 为真菌抵御渗透压和机械力等提供保护[1]。几丁质作为细胞壁的重要成分之一在含量上随菌种的不同而有较大差别, 在酿酒酵母中占细胞壁干重的1−2%, 在构巢曲霉中可达20%。同一菌种的细胞壁几丁质含量也会随着其基因变化和生理状态的不同而改变, 例如在FKS1缺失的酿酒酵母突变株中其细胞壁的几丁质
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2003CB114400) *通讯作者:
Tel: 0571-88320741; : [email protected] 收稿日期:2007-05-18; 接受日期: 2007-09-07
含量明显增加[2]。
几丁质合成是一个复杂的过程, 其关键酶为几丁质合酶(chitin synthase, CS)。几丁质合酶(CS)(EC 2.4.1.16) 的作用是催化二磷酰基N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)形成β-1,4-键连接的线状纤维素样聚合物, 称为几丁质。
在不同的真菌中存在着一种至多种类别的CS 同功酶[3,4]。这些同功酶在维持细胞壁完整性, 菌丝
268
微生物学通报
2008, Vol.35, No.2
正常生长和无性孢子产生等方面起重要作用[5,6]。在致病真菌中还发现一些CS 基因的缺失会使菌株的生长速率和感染能力同时减弱[7]。由于在动物和植物中不存在几丁质, CS被认为是抗真菌药物的理想靶标。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CS 的分子生物学研究发现, 存在3种CS 结构基因(Scchs1、 Scchs2和Scchs3) 编码CS1, CS2和CS3, 分别在酵母细胞分裂后的修复、初级隔膜的形成和几丁质环及侧壁几丁质合成中起作用[8]。近年来丝状真菌中的CS 研究有了大的突破, 研究发现大部分丝状真菌具有7种类别的CS 。本文对这7类CS 的结构特点和作用模式作了综述, 重点讨论了丝状致病真菌中重要的CS 类别, 并介绍了CS 作为抗真菌药物有效靶标的研究现状, 旨在为研究真菌CS 及其抑制剂提供参考。
1 真菌几丁质合酶基因
在模式真菌酿酒酵母中存在3个CS 结构基因, Scchs1、Scchs2和Scchs3, 分别编码CS1, CS2, CS3[8]。假丝酵母(Candida albicans) 是临床上重要的人体条件致病菌, 一直以来人们都认为该菌中仅含有3种CS 结构基因, Cachs1, Cachs2和Cachs3。直至Cachs8的发现才证明该菌株中共有4个结构基因存在[9]。
丝状真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans) 是模式真菌, 在该菌中至少存在6个CS 结构基因, 分别命名为AnchsA , AnchsB , AnchsC , AnchsD , AncsmA 和AncsmB [10]。烟曲霉(Aspergillus fumigatus) 也是临床上重要的人体条件致病真菌, 至今已经从烟曲霉中扩增了7个CS 结构基因, 分别命名为AfchsA , AfchsB , AfchsC , AfchsD , AfchsE , AfchsF 和AfchsG [11]。灰霉(Botrytis cinerea) 是一种重要的植物致病真菌, 变异性极强。目前已经发现在该菌中至少有8个CS 结构基因存在, 分别命名为Bcchs Ⅰ, Bcchs Ⅱ, Bcchs Ⅲa , Bcchs Ⅲb , Bcchs Ⅳ, Bcchs Ⅴ, Bcchs Ⅵ, Bcchs Ⅶ[12]
。
其它如玉米黑粉菌[13] (Ustilago maydis) 、禾柄锈
http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn
菌[14] (Puccinia graminis) 、Wangiella (Exophiala) der-matitidis [15]、镰刀菌[16] (Fusarium oxysporum) 米曲霉[17] (Aspergillus oryzae) 等多种重要真菌中都已经开展了CS 的分子生物学研究。目前研究的重点正在从模式真菌转向致病真菌, 对其中与致病性相关的几丁质合酶基因正在加紧进行基因克隆以及功能分析的研究。 2 几丁质合酶的分类与结构
2.1 几丁质合酶的分类
目前已经测序的CS 基因有上百种, 根据其推定的氨基酸序列特征及相似性可以将之归为7类。本文通过clustal X软件对几种在理论、临床和农业上重要真菌的CS 基因作了比对分析(图1) 。
图1 几种重要真菌几丁质合酶分类树
Fig. 1 The phylogenetic tree of fungal chitin synthases
An: Aspergillus nidulans; Af: Aspergillus fumigatus; Bc: Botry-tis cinerea; Ca: Candida albicans; Nc: Neurospora crassa; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Um: Ustilago maydis; Wd: Wangiella (Exophiala ) dermatitidis
从图1可以发现酿酒酵母CS 基因Scchs1、
冯贻安等: 真菌几丁质合酶的研究进展
269
Scchs2和Scchs3分属于Ⅰ, Ⅱ, Ⅳ类。假丝酵母CS 基因Cachs1, Cachs2, Cachs3和Cachs8分属于Ⅱ, Ⅰ, Ⅳ, Ⅰ类。而丝状真菌(如构巢曲霉和灰霉等) 的CS 基因不仅包括与酵母CS 相似的Ⅰ, Ⅱ, Ⅳ类, 还包含在酵母中不存在的类别Ⅲ, Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ类。
//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对丝状真菌的Ⅰ到Ⅵ类CS 基因的氨基酸序列进行结构域分析和跨膜域预测, 得到CS 结构的示意图(图2) 。可以发现家族Ⅰ(familyⅠ) 包括Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ类CS 都含有催化结构域Ⅰ(Chitin_synth_1)和多次跨膜域(multi- transmembrane domain, MTM)。而家族II(familyⅡ) 包括Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ类含有催化结构域2(Chitin_synth_2)和细胞色素b5结构域(cyt-b5), 其中Ⅴ, Ⅵ类还含有肌动蛋白头结构域(Myosin motor head)[12]。
2.2 几丁质合酶的结构
CS 是膜结合蛋白, 由于膜结合蛋白提取纯化难度大, 难以得到蛋白质晶体, 因此CS 至今尚未有X-射线的三维结构的直接证据。目前对CS 结构的理解主要依赖于对其氨基酸序列的分析。
通过NCBI 的Blast 和TMHMM 软件(http:
图2 真菌几丁质合酶的结构示意图
Fig. 2 Characterization of the structure of fungal CS
3 几丁质合酶的生物学功能
酿酒酵母CS 的功能是目前研究得最清楚的, CS3(Ⅳ类) 在细胞周期开始时, 在细胞出芽位点处
慢、不产孢子、菌丝尖端膨大和侧壁异常等表型缺陷, 并且不能通过添加渗透稳定剂来挽回[18]。但是在W. dermatitidis 中的Ⅲ类CS 基因的敲除仅使CS 活性有所下降, 但生长速率、形态、毒力、几丁质含量等都不受影响[19]。烟曲霉中存在两个Ⅲ类CS 基因AfchsC 和AfchsG , AfchsG 的敲除会使菌株产生明显的表型缺陷, 而AfchsC 敲除的表型与野生型无异[20], 表明在某些丝状真菌中存在两个相似的Ⅲ类CS 基因, 而仅有一种Ⅲ类CS 基因在生命活动中起重要作用。
通过对构巢曲霉Ⅴ类CS 基因(AncsmA ) 的研究发现, 该基因在低渗条件下表达量高, 而在高渗条件下则几乎不表达[6]。AncsmA 基因敲除后菌株在低渗萌发时容易裂解, 菌丝沿长度方向膨胀、形成空泡, 对几丁质结合染料及抑制剂敏感, 产生内生菌丝等缺陷, 而这些表型缺陷能通过添加渗透稳定剂来部分挽回[6,21]。由此可以推测, Ⅴ类CS 的功能是维持细胞壁的完整性, 并在低渗条件下起尤为关键
http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn
合成几丁质环; CS2 (Ⅱ类) 在有丝分裂末期, 在母细胞和子细胞之间合成初级隔膜; 而CS1 (Ⅰ类) 则是假丝酵母CS 的功在细胞分裂后起修复损伤作用。
能与酿酒酵母相似, Ⅳ类(Cachs3p)是主要的CS 参与大部分几丁质的合成, Ⅱ类(Cachs1p)参与细胞隔膜的形成, Ⅰ类可能与修复损伤有关。
与酵母相比, 丝状真菌中存在更多类别的CS 同功酶。丝状真菌中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅶ类CS 基因的单基因敲除通常不会导致明显表型缺陷, 但是Ⅲ、Ⅴ或Ⅵ类CS 单个基因的敲除却往往能导致菌株表型的明显缺陷, 说明在丝状真菌中Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ类CS 扮演重要的角色[7,10,11]。
构巢曲霉的Ⅲ类CS 基因(AnchsB ) 在整个发育过程中都表达, AnchsB 敲除后导致菌株生长速率减
[9]
[8]
270
微生物学通报
2008, Vol.35, No.2
的作用。
Ⅵ类与Ⅴ类CS 基因具有类似的结构, 但是目前对Ⅵ类CS 基因的研究相对较少。在构巢曲霉中发现Ⅵ类与Ⅴ类CS 的功能类似, 同时敲除Ⅵ类与Ⅴ类CS 基因的构巢曲霉是致死的[10]。在玉米黑粉菌中, 单独敲除Ⅴ或Ⅵ类CS 基因都不会使菌株产生明显的表型缺陷, 而同时敲除Ⅴ或Ⅵ类CS 基因会导致突变株膨胀, 表明Ⅵ类CS 在功能上与Ⅴ类部分重复, 并在维持细胞壁完整性中起作用[13,22]。
4 几丁质合酶与致病性的关系
在致病真菌中CS 不仅对维持细胞生长起重要作用, 还与致病能力有密切关系。玉米黑粉菌的8个CS 基因中, Ummcs1、Umchs5、Umchs6和Umchs7的缺失都会导致菌株感染能力下降, 尤其是Ummcs1(Ⅴ类) 或Umchs6(Ⅵ类) 的缺失几乎使菌株失去对玉米的感染力
[13,22]
。而Umchs7(Ⅳ类) 、
Umchs5(Ⅳ类) 敲除导致毒力下降说明在二态菌玉米黑粉菌中, Ⅳ类CS 基因可能在酵母态中起重要作用[13]。Soulie 等分别将灰霉的Bcchs Ⅰ(Ⅰ类) 和 Bcchs Ⅲa (Ⅲ类) 敲除后, 发现这两个基因缺失都会导致菌株致病能力的下降, 其中Bcchs Ⅲa 敲除后的致病能力下降更为明显[7,24]。假丝酵母的Cachs1的条件突变株在该基因受抑制条件下失去毒性[25]。烟曲霉AfchsC 缺陷后致病能力与野生型相同, 而同时敲除AfchsC 、AfchsG 会使致病能力下降70%, 表明AfchsC 在生物学功能和致病能力中都不起作用, 而AfchsG 则在两个方面都起重要作用[20]。在W. der-matitidis 中只有Wdchs5(Ⅴ类) 的缺失才导致菌株在37℃致病能力的下降[15]。镰刀菌的Fochs2(Ⅱ类) 和Fochs Ⅴ(Ⅴ类) 缺失都会使菌株致病能力下降, 其中Fochs Ⅴ的缺失几乎导致菌株致病能力丧失
[16,26]
。
多种类别的CS 基因敲除都会导致致病真菌的毒力下降, 表明真菌毒力与CS 存在着较为复杂的关系。但对玉米黑粉菌、灰霉和镰刀菌等致病菌中的CS 与致病能力相关性研究发现不同类别CS 基因缺失导致毒力下降的程度各异, 其中Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ类CS 缺失导致的毒力下降更为明显, 表明在致病能力中这三类CS 也同样起关键作用[7,13,16,22]。
5 展望
真菌细胞壁被认为是抗真菌药物的理想靶标,
http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn
抗真菌药物的开发是目前的研究热点之一。研究发现在酿酒酵母中不同的CS 同功酶对药物的敏感性不同, 如尼克霉素(nikkomycin Z)对CS3有较好的抑制效果, 而CS2则对其有抗性[27]。最近发现在植物提取物中, 厚朴(Magnolia obovata) 中的obovatols 、东北红豆杉(Taxus cuspidata) 中的儿茶酸、山楂(Crataegus pinnatifida) 中的熊果酸都对CS2有比较明显的抑制效果, 其中熊果酸对CS2的IC 50低至1.8 µM [28]。因此, 同时使用上述两类抑制剂可能会极大的提高防治真菌感染效果。
真菌细胞壁几丁质合成是一个复杂的过程, 并且大部分临床和农业中重要的病原真菌都是丝状真菌, 而丝状真菌的CS 种类更多, 作用机制更为复杂。目前国内对丝状真菌CS 的研究仍较少, 对这些
重要病原真菌中CS 基因及其调控机理的研究必将极大的促进新型抗真菌药物的研制和发展。
参 考 文 献
[1] Frans MK, Pieternella M, Klaas H, et al. Dynamics of cell
wall structure in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Micro-biology Reviews, 2002, 26(3): 239−256.
[2] Garcia-Rodriguez LJ, Trilla JA, Castro C, et al. Charac-terization of the chitin biosynthesis process as a compen-satory mechanism in the fks1 mutant of Saccharomyces cerevisiae . FEBS Letters, 2000, 478(1−2): 84−88. [3] 李秀峰, 庄佩君, 唐振华. 真菌中的几丁质合成酶. 世
界农药, 2000, 22(5): 33−38.
[4] Roncero C. The genetic complexity of chitin synthesis in
fungi. Curr Genet, 2002, 41(6): 367−378.
[5] Fujiwara M, Ichinomiya M, Motoyama T, et al. Evidence
That the Aspergillus nidulans Class I and Class II Chitin Synthase Genes, chsC and chsA , Share Critical Roles in Hyphal Wall Integrity and Conidiophore Development. J Biochem , 2000, 127(3): 359−366.
[6] Yamada E, Ichinomiya M, Ohta A, et al. The class V chi-tin synthase gene csmA is crucial for the growth of the chsA chsC double mutant in Aspergillus nidulans. Biosci Biotechnol Biochem, 2005, 69(1): 87−97.
[7] Soulie MC, Perino C, Piffeteau A , et al. Botrytis cinerea
virulence is drastically reduced after disruption of chitin synthase class III gene ( Bcchs3a ). Cellular Microbiology, 2006, 8(8): 1310−1321.
[8] Schmidt M. Survival and cytokinesis of Saccharomyces
冯贻安等: 真菌几丁质合酶的研究进展
cerevisiae in the absence of chitin. Microbiology , 2004, 150(10): 3253−3260.
[9] Munro CA, Whitton RK, Hughes HB, et al. CHS8 — a fourth
chitin synthase gene of Candida albicans contributes to in vi-tro chitin synthase activity, but is dispensable for growth. Fungal Genetics and Biology, 2003, 40(2): 146−158. [10] Takeshita N, Yamashita S, Ohta A, et al. Aspergillus
nidulans class V and VI chitin synthases CsmA and CsmB , each with a myosin motor-like domain, perform compen-satory functions that are essential for hyphal tip growth. Molecular Microbiology, 2006, 59(5): 1380−1394. [11] Mellado E, Dubreucq G, Mol P, et al. Cell wall biogenesis
in a double chitin synthase mutant (chsG -/chsE -) of As-pergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology, 2003, 38(1): 98−109.
[12] Choquer M, Boccara M, Goncalves IR, et al. Survey of
the Botrytis cinerea chitin synthase multigenic family through the analysis of six euascomycetes genomes. Eur J Biochem , 2004, 271(11): 2153−2164.
[13] Weber I, Assmann D, Thines E, et al. Polar Localizing
Class V Myosin Chitin Synthases Are Essential during Early Plant Infection in the Plant Pathogenic Fungus Ustilago maydis. The Plant Cell, 2006, 18(1): 225−242. [14] Broeker K, Fehser S, Moerschbacher BM. Survey and ex-pression analysis of five new chitin synthase genes in the biotrophic rust fungus Puccinia graminis. Curr Genet, 2006, 50(5): 295−305.
[15] Liu HB, Kauffman S, Becker JM, et al. Wangiella (Exo-phiala) dermatitidis WdChs5p, a Class V Chitin Synthase, Is Essential for Sustained Cell Growth at Temperature of Infection. Eukaryotic Cell, 2004, 3(1): 40−51.
[16] Madrid MP, Di Pietro A, Roncero MI. Class V chitin syn-thase determines pathogenesis in the vascular wilt fungus Fusarium oxysporum and mediates resistance to plant de-fence compounds. Mol Microbiol, 2003, 47(1): 257−266. [17] Muller C, Hjort CM, Hansen K, et al. Altering the expres-sion of two chitin synthase genes differentially affects the growth and morphology of Aspergillus oryzae. Microbi-ology , 2002, 148(12): 4025−4033.
[18] Lee JI, Choi JH, Park BC, et al. Differential expression of
the chitin synthase genes of Aspergillus nidulans, chsA , chsB , and chsC , in response to developmental status and
271
environmental factors. Fungal Genetics and Biology, 2004, 41(6): 635−646.
[19] Wang Z, Szaniszlo PJ. WdCHS3, a gene that encodes a
class III chitin synthase in Wangiella (Exophiala ) derma-titidis , is expressed differentially under stress conditions. J Bacteriol, 2000, 182(4): 874−881.
[20] Mellado E, Aufauvre-Brown A, Gow NAR, et al. The As-pergillus fumigatus chsC and chsG genes encode Class III chitin synthases with different functions. Mol Microbiol, 1996, 20(3): 667−679.
[21] Takeshita N, Ohta A, Horiuchi H. csmA, a gene encoding
a class V chitin synthase with a myosin motor-like domain of Aspergillus nidulans, is translated as a single polypep-tide and regulated in response to osmotic conditions. Bio-chem Biophys Res Commun, 2002, 298(1): 103−109. [22] Garcera-Teruel A, Xoconostle-Cazares B, Rosas-Quijano
R, et al. Loss of virulence in Ustilago maydis by Umchs6 gene disruption. Res Microbiol, 2004, 155(2): 87−97. [23] Horiuchi H, Fujiwara M, Yamashita S, et al. Proliferation
of intrahyphal hyphae caused by disruption of csmA , which encodes a class V chitin synthase with a myosin motor-like domain in Aspergillus nidulans. J Bacteriol, 1999, 181(12): 3721−3729.
[24] Soulie MC, Piffeteau A, Choquer M, et al. Disruption of
Botrytis cinerea class I chitin synthase gene Bcchs1 re-sults in cell wall weakening and reduced virulence. Fungal Genet Biol, 2003, 40(1): 38−46.
[25] Munro CA, Winter K, Buchan A, et al. Chs1 of Candida
albicans is an essential chitin synthase required for syn-thesis of the septum and for cell integrity. Mol Microbiol, 2001, 39(5): 1414−1426.
[26] Martin-Udiroz M, Madrid MP, Roncero MI. Role of chitin
synthase genes in Fusarium oxysporum. Microbiology , 2004, 150(10): 3175−3187.
[27] Gaughran JP, Lai MH, Kirsch DR, et al. Nikkomycin Z is
a specific inhibitor of Saccharomyces cerevisiae chitin synthase isozyme Chs3 in vitro and in vivo. J Bacteriol, 1994, 176(18): 5857−5860.
[28] Behr JB. Chitin Synthase As an Antifungal Target Recent
Advances. Current Medicinal Chemistry-Anti-Infective Agents , 2003, 2(2): 173−189.
http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn