病毒样颗粒技术的研究进展_郭建强

中国疫苗和免疫 2009 年 4 月第 15 卷第 2 期

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· 综 述 ·

病毒样颗粒技术的研究进展

郭建强 综述，张智清 审校

(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室，北京 100052)

摘要：病毒样颗粒(Virus-like Particles，VLPs) 为不含病毒基因组的空壳或包膜状颗粒结构，与天然病毒颗粒结构相似。VLPs 技术在病毒的组装与形态多样性等基础研究中发挥了重要作用。VLPs 作为疫苗，可有效诱导机体产生免疫反应。VLPs 具有独特的免疫学特性，不但能通过影响抗原递呈细胞发挥佐剂效应，还可以作为其它佐剂、多肽疫苗和核酸疫苗的整合平台设计多种形式的疫苗。在适宜条件下，VLPs 可以包裹核酸或其它小分子物质，因此可以作为分子运载工具靶向性地递送基因或药物。VLPs 还可以替代天然病毒在免疫学检测中发挥重要作用。关键词：病毒样颗粒；疫苗；载体；免疫学检测

中图分类号：R373 文献标识码：A 文章编号：1006-916X(2009)02-0167-07

Progress in Virus-Like Particles Technique Studies GUO Jian-qiang, ZHANG Zhi-qing (State Key

Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China)

Abstract: Virus-like particles (VLPs) structurally mimic the authentic virus whereas contain no viral genome. VLPs technique plays an important role in basic research such as virus assembly and virus morphology diversity. With special immunology properties, VLPs vaccine can induce immune response effectively. VLPs can act as adjuvant by regulating dendritic cells. Other adjuvant or polypeptide can be integrated into VLPs to construct chimeric vaccines. With the capability of packaging nucleic acid or other small molecules, VLPs can be used for vehicles to deliver these substances under suitable conditions. VLPs can substitute natural virus in immunology assay.Key words: Virus-like particles; Vaccine; Vehicle; Immunology assay病毒样颗粒(Virus-like Particles, VLPs)，也称为核心样颗粒(Core-like Particles, CLPs)，是由病毒的结构蛋白组装而成的介于15nm ～400nm 的空心颗粒。VLPs 不含病毒基因组，不能自主复制，在形态上与真正病毒粒子相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体产生免疫保护反应。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力，这为病毒的基础研究及疫苗的开发提供了便利条件。VLPs 可以通过基因工程或化学交联的方法对其表面进一步修饰和改造成为嵌合或交联疫苗。多数VLPs 具有包裹核酸或其它小分子的能力，可以用作基因或药物的运载工具。近年来，

随着对病毒生物学特征研究的深入和技术手段的进步，VLPs 技术在生物医药领域取得了很大的进展。本文主要对VLPs 的表达系统、构建方法及其在生物医学方面的应用进行讨论。1 VLPs构建方法及表达系统

VLPs 由病毒的结构蛋白装配而成，如人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)的晚期蛋白1(Late Protein 1，L 1) 和晚期蛋白2(L2) 是主要和次要结构蛋白，在细胞中均可以自行装配成VLPs 。对于无包膜病毒，其VLPs 组分来源于病毒的衣壳蛋白(或其突变、修饰体) 。病毒衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力，VLPs 可以直接从表达病毒衣壳蛋白的细胞或培养基中分离得到，也可以先将衣

收稿日期：2008-12-19；修回日期：2009-02-02

作者简介：郭建强(1974-)，男，吉林省白山市人，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所在读博士研究生，主要从事流行性感冒病毒新型疫苗研究。

壳蛋白亚基纯化后，在体外组装成VLPs 。对于有包膜病毒，可以是包膜内的衣壳蛋白(或其突变、修饰体) 构成的壳粒结构，也可以是由该种病毒的

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膜蛋白(或其突变、修饰体) 镶嵌于宿主细胞膜上出芽后形成的含有病毒膜蛋白的脂双层微球。

VLPs 的制备原理是在体外高效表达某种病毒的一种(或几种) 结构蛋白，使其自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒。其方法主要是将病毒结构蛋白基因克隆到表达载体中，再将这些载体转入原核或真核细胞中进行表达。绝大多数VLPs 的构建选择的都是真核细胞表达系统，使用原核表达系统的较少，主要是由于原核表达系统不能对蛋白进行必要的修饰，不利于VLPs 的形成。目前已有报道通过多种系统表达病毒结构蛋白成功构建VLPs ，如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及原核细胞表达系统。

1.1 酵母细胞表达系统 酵母细胞能对表达的蛋白进行糖基化修饰，表达水平高、易于放大、成本低。1997年新加坡国立大学通过毕赤酵母表达登革病毒2型全部结构蛋白成功构建了VLPs [1]。目前已有报道使用酵母细胞表达系统成功构建了HPV VLPs[2]和丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)VLPs [3]。德国默克公司使用酿酒酵母表达系统成功地开发出HPV VLPs疫苗，并于2006年获得美国食品药品管理局(FDA)的上市批准。但酵母细胞在表达病毒结构蛋白中也有局限，由于毕赤酵母的生长需要甲醇诱导，表达的蛋白糖基化修饰限于甘露糖，且修饰不一致。另外，许多基因在采用酵母系统表达时需要进行密码子优化，限制了它的使用。

1.2 植物细胞表达系统 已有人尝试培育出了含L 1 VLPs(HPV11) 的转基因马铃薯，以此马铃薯为饲料的实验小鼠血清中检测到了高滴度的L 1特异性抗体[4]。Meshcheriakova 通过改造后的新型豇豆花叶病毒载体，成功表达了乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)核心抗原(Core Antigen, HBcAg)，并检测到了HBcAg VLPs[5]。

1.3 杆状病毒/昆虫细胞表达系统 杆状病毒基因组具有容纳大量外源基因的能力，可以同时表达几种病毒结构蛋白，该系统可在细胞培养基中高密度大量表达外源蛋白。杆状病毒的宿主范围窄，不感染人类，病毒灭活方法简单。该表达系统能对病毒结构蛋白进行多种修饰，利于正确包装VLPs 。在昆虫细胞内表达的病毒结构蛋白可以自组装成VLPs 并分泌到培养基中，可以采用蔗糖密度梯度离心的方法纯化VLPs ，纯化后的VLPs 不含哺乳

动物细胞组分，安全性好，因此该系统广泛用于构建VLPs 。有研究者将流行性感冒(流感) 病毒甲(A)/香港/1073/99株血凝素(Hemagghutinin, HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)和基质蛋白1(Matrix Protein 1，M 1) 基因克隆至杆状病毒表达载体，转染Sf 9昆虫细胞，蔗糖密度梯度离心收获VLPs 。凝胶过滤层析、电镜检测到了流感病毒VLPs [6]。1.4 哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞能够对其所表达的外源蛋白进行多种修饰，使其能够形成正确的天然构象。多种哺乳动物细胞，如293/非洲绿猴肾细胞(African Green Monkey Kidney Cells, COS)/中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞系均可用于表达病毒结构蛋白构建VLPs 。目前已成功构建了HPV 、HCV 、人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV) VLPs。但目前哺乳动物细胞表达系统尚不成熟，实验材料昂贵，细胞生长表达周期长，生产工艺不易操控，用其表达的包膜病毒VLPs 在自组装过程中经常带有非必需的宿主细胞膜蛋白，这些都限制了它的大规模应用。

1.5 原核细胞表达系统 研究表明，原核细胞表达HPV L1蛋白可高效地组装成VLPs 。HPV16型( HPV 16) L1蛋白在鼠伤寒沙门氏菌中表达，可获得VLPs ，结构与天然HPV 类似，首次证实HPV L1蛋白能够在原核细胞中自行组装成VLPs [7]。Chuan YP 等对宿主株系、表达质粒、诱导剂浓度、培养条件进行了筛选与优化，通过低密度大肠杆菌高水平表达形成VLPs 的可溶性结构蛋白，表达水平达到了180mg/L[8]。

2 VLPs技术在基础研究中的应用

通过VLPs 技术，可以研究病毒的主要结构蛋白在病毒颗粒的形成、出芽及病毒颗粒形态多样性方面的作用。蓝舌病病毒(BTV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae ) 环状病毒属的原型株，是一类无包膜的结构复杂的病毒。这些20面体病毒含有7种主要病毒结构蛋白(Viral Structural Proteins, VP; VP 1～VP 7) ，构成双层蛋白外壳。它的外层蛋白外壳主要由VP 2和VP 5构成，内层则由VP 3和VP 7构成，两层蛋白外壳包绕着另三种结构蛋白：VP 1、VP 4、VP 6及病毒基因组。研究表明，VP 3、VP 7共表达可获得CLPs ，VP 2、VP 3、VP 5、VP 7共表达可获得VLPs [9]。柯昌文等研究了人多瘤病毒BK 株VP 1的C 末端正电荷残基对VLPs 形成和其结合脱氧核

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糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA)的影响。将正电荷残基变成丙氨酸，然后表达VP 1蛋白。结果发现R 281被丙氨酸取代后，仅在细胞中形成少量的VLPs ，而R 285被丙氨酸取代后不能形成VLPs 。表明正电荷氨基酸残基R 281和R 285是形成VLPs 所必需的。用丙氨酸替代K 288、R 290、R 292、K 293、R 294后仍能形成VLPs ，但与野毒株相比，在VLPs 分泌以及衣壳蛋白与细胞DNA 的结合方面有差异，表明K 288、R 290、R 292、K 293、R 294和K 297影响VLPs 和DNA 的结合[10]。

Szécsi J等通过共表达禽流感病毒表面蛋白HA 、NA 和基质蛋白2(Matrix Protein 2, M2) 对形成VLPs 的影响进行了研究。实验表明，M 2蛋白不影响颗粒中HA 及NA 的组成，但如无NA 的表达，则在颗粒中仅能检测到极少量的HA ，这可能是由于缺乏NA 时，无法切除唾液酸，影响了含有HA 蛋白的病毒颗粒有效释放到胞外。同样，如果用纯化的NA 蛋白处理细胞，则可促进含HA 蛋白的病毒颗粒从细胞表面释放[11]。研究表明，副粘病毒只要有M 1蛋白表达即可形成VLPs ，以出芽形式释放出来。研究发现，M 1蛋白是形成流感病毒颗粒的唯一必需蛋白，并且是病毒颗粒出芽的主要驱动力。如果HA 和NA 蛋白缺失胞内尾部序列，则会降低病毒颗粒的出芽比率并降低颗粒的感染性，NA 蛋白缺失胞内尾部序列还会改变病毒颗粒的形态。M 1蛋白同HA 蛋白共表达，HA 蛋白会降低M 1蛋白在细胞膜内形成管状结构的趋向性，使M 1蛋白更易结合到细胞膜上[12]。Yasushi M研究发现，丙型流感病毒C/安阿伯(Ann Arbor)/1/50的M 1蛋白的24位氨基酸是形成核心颗粒的必需氨基酸[13]。Boscarino JA 等研究发现，鼠冠状病毒包膜蛋白的棕榈酰化对其病毒装配是必需的[14]。

通过VLPs 技术，可以研究赋形剂对病毒颗粒的结构稳定作用。由于VLPs 抗原表位的天然重复结构在颗粒表面高密度排列，其用做疫苗时，常可引起强烈的免疫反应，为维持这些抗原的免疫原性，无论是表位还是整体颗粒都应形成稳定结构。Kissmann J等对诺瓦克病毒(Norwalk Viruses, NV) VLPs 的稳定性进行了研究，先初步筛选出能够在水溶液中抑制NV VLPs聚集的赋形剂，再在热压力条件下使用生物与物理方法对NV VLPs结构进行检测，研究热稳定性的机制及评价这些赋形剂的热稳定效果。研究发现，在溶液中添加壳聚糖、谷氨酸

盐、蔗糖、海藻糖，NV VLPs热稳定性增加，其机制与NV VLPs的二级、三级结构相关联[15]。3 VLPs疫苗及嵌合VLPs 疫苗研究

3.1 VLPs疫苗 自从在HBV 感染者血液样品中发现HBV 表面抗原(Surface Antigen, HBsAg)颗粒，并被证实该颗粒可以作为乙肝疫苗(Hepatitis B Vaccine, HepB) 以来[16]，VLPs 技术在新型疫苗的研究开发工作中迅速发展。VLPs 疫苗无感染性，安全性好。同亚单位或重组蛋白相比，因其空间结构与天然病毒相同或相近，可以使其正确高密度地呈现抗原表位，提高了刺激产生中和抗体的能力，可刺激机体产生特异性体液和细胞免疫，特别是对于包膜VLPs ，因为带有抗原表位的外膜蛋白嵌入脂质体膜，其表面结构域明显优于单个游离的可溶性蛋白的结构域。同时，VLPs 疫苗稳定性好，不易失活，开发应用前景广阔。

3.1.1 流感病毒VLPs 疫苗研究 流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae ) 。禽类与人类的流感病毒之间发生基因重配，可能导致流感病毒在人群间迅速大规模流行。流感病毒的HA 、NA 和M 2嵌入到病毒颗粒包膜，膜内层为M 1。HA 可以识别靶细胞受体并与之结合，并能诱导产生保护性中和抗体，是流感疫苗的重要组成部分。NA 能防止子代病毒聚集，促进病毒出芽，也是流感疫苗的重要组成部分。M 1是流感病毒的主要结构蛋白，在病毒复制中具有重要的调节功能[17]。M 1调节子代病毒颗粒装配，还可与HA 、NA 、M 2的膜内区相互作用，稳定病毒颗粒核心部分。M 2不仅可诱导机体产生抗体，而且是细胞毒性T 淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphoclyte, CTL)的靶抗原，可以用作流感疫苗的抗原成分。研究发现，流感病毒的四种膜蛋白(M1、M 2、HA 、NA) 在细胞膜上相互作用，可以形成流感病毒VLPs [18]。因此，对于流感病毒VLPs 的研究焦点集中在这四种膜蛋白上。

实验证明，仅M 1和HA 两种蛋白在细胞膜上相互作用，即可形成VLPs ，使用该VLPs 获得了较好的动物免疫效果[19,20]。Prel A等通过共表达低致病性禽流感病毒H 7N 1的HA 和NA 及H 5N 3的M 1构建流感病毒VLPs ，电镜观察到的VLPs 形态与野病毒相同。HA 、NA 均位于VLPs 表面，检测到了HA 与NA 的生物学活性，免疫动物后产生了具有血凝抑制(Hemagglutination Inhibition, HAI)活性的抗体[21]。Pushko P研究发现，由HA 、NA 、M 1组

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成的流感病毒VLPs 可以作为抗H 9N 2禽流感病毒的候选疫苗，可诱导BALB/c小鼠产生保护性免疫应答。该研究采用杆状病毒/昆虫细胞表达系统共表达流感病毒A/香港/1073/99 HA、NA 、M 1，成功构建出具有HA 活性和NA 功能的VLPs 。雌性BALB/c小鼠皮下接种VLPs ，初免后所有动物血清抗A/香港/1073/99病毒抗体阳性。BALB/c小鼠肌内注射VLPs 后，用A/香港/1073/99病毒进行鼻腔攻击。结果显示相对于对照组，VLPs 免疫小鼠体重下降幅度减少，攻击后5d ，全部5只VLPs 免疫小鼠的鼻组织中均未检出病毒，其中3只肺内未检出病毒；而对照组小鼠的肺、上呼吸道组织内检测到活跃复制的流感病毒[6]。Novavax, Inc.在流感病毒VLPs 开发中取得了很大的进展，目前的季节性感冒疫苗的成分几乎都是HA ，而Novavax 专有的VLPs 疫苗包含HA 、NA 以及H 5N 1 A/印度尼西亚(Indonesia)病毒株的M 1。公司2008年8月宣布了人体临床试验第二阶段的积极结果，该疫苗能够诱导中和抗体来预防感染，并减轻流感症状。该疫苗不含佐剂，但可引起强烈的中和抗体应答。

3.1.2 HIV VLPs疫苗研究 HIV属于逆转录病毒科(Retroviridae ) 慢病毒亚科，是引起人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) 的病原体。目前还无一种药物能完全制服HIV ，因而通过疫苗预防HIV 的感染就成为一种更为经济有效的途径。然而迄今为止，在非人灵长类和人体早期试验中，已经证实传统形式的疫苗在预防HIV 感染和AIDS 发生上均是无效的，而且具有很大的局限性：如减毒活疫苗具有潜在的致病性；带佐剂的灭活疫苗只能诱导有限的特异性中和抗体且缺乏CTL 应答；重组外膜蛋白疫苗只诱导针对病人HIV-1的非中和抗体，并且缺乏CTL 应答。而HIV VLPs具有很强的免疫原性，不进行自我复制，不含致病性颗粒，不破坏宿主免疫系统，安全性好，所以HIV VLPs作为HIV 的侯选疫苗倍受学者们的重视。

体液免疫和细胞免疫应答是控制HIV 感染和复制的关键。Yao Q建立了杆状病毒表达系统，高水平表达被膜蛋白(Envelope Glycoprotein, Env)的HIV 和猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus, SIV) VLPs生产系统。免疫原性评价结果表明，VLPs 预防接种可诱导细胞免疫和中和抗体应答，而且VLPs 经黏膜途径接种有效地诱导了黏膜和全

身免疫应答。作者也合成了HIV Env蛋白的优化密码子基因，并评估了它的免疫原性[22]。

中国疾病预防控制中心(CDC)性病艾滋病预防控制中心，在对中国HIV 流行株进行了大规模的分子流行病学调查的基础上，选取HIV-1 B、C 和E 亚型代表株分别进行了基因克隆和表达，获得了基于种群特异性抗原(Group Specific Antigen, Gag)和Gag-V 3基因的VLPs 。电镜下可以观察到与天然HIV 毒粒形态相似的VLPs 以及VLPs 从细胞中出芽的过程。小鼠免疫实验结果证明VLPs 可以诱导很强的体液免疫，而且通过细胞因子等指标的检测发现，VLPs 可以诱导产生一定程度的细胞免疫。

Diaz-Griffero F在小鼠细胞中稳定表达密码子优化后的HIV-1 Gag-多聚酶蛋白(Polymerase, Pol)结构(Gag-Pol)，可有效产生并释放VLPs 。相比人细胞，在小鼠 NI H 3T 3和A 9细胞中可更高效产生和释放VLPs 。通过高效瞬时转染，提高了Gag 蛋白的表达，并能产生有感染性的HIV VLPs。这对建立HIV/AIDS小鼠研究模型奠定了基础[23]。

3.1.3 HPV VLPs疫苗研究 HPV属于乳多空病毒科(Papovaviridae ) 乳头瘤病毒属，感染某些亚型的HPV 后易发生宫颈癌。病毒体由L 1和L 2组成。研究发现，在许多表达系统，如哺乳动物细胞、酵母和细菌中，单独L 1或L 1和L 2共表达后可自行组装成VLPs 。L 2不是形成VLPs 必需的，但它可稳定L 1衣壳的构成[24，25]。L 1表面存在中和抗体的表位，用L 1 VLPs免疫动物可诱导产生高滴度的中和抗体

[24，26]

。HPV VLPs与天然病毒颗粒有相似的空间构

象、免疫特性和生物学活性，并可进行大规模制备和纯化，可以替代不易培养的天然HPV ，广泛用于疫苗研究。

L 1 VLPs的免疫表位具有型特异性[27]，因此，研究多价HPV VLPs疫苗具有重要意义。HPV 16和HPV18型(HPV18) 引起大约70%的宫颈癌。Harper DM 等通过临床实验证明，HPV 16/HPV18 L1 VLPs两价疫苗能有效预防女性HPV 16/HPV18感染[28]。2006年底，HPV L1 VLPs 四联疫苗(HPV6/11/16/18) 已经在欧洲上市。

3.1.4 其它VLPs 疫苗研究 除流感病毒、HIV 、HPV 外，对其它多种VLPs 疫苗也进行了研究开发。如Warfield KL评价了由埃博拉病毒(Ebola Virus, EBOV)糖蛋白(Glycoprotein, GP)、核蛋白(Nucleoprotein, NP)和基质蛋白 VP40构成的

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VLPs(eVLPs)疫苗对非人灵长类的免疫保护效果。通过对猕猴、短尾猴免疫eVLPs 后攻击EBOV ，结果全部5只免疫eVLPs 的实验动物均存活，且无临床或实验室感染症状，而对照组动物死亡[29]。用家兔肾综合征出血热病毒构建的VLPs 具有高免疫原性，在佐剂共免疫情况下，VLPs 可以被树突状细胞识别并摄取，促进机体内多种分化群(Cluster of Differentiation, CD)分子的表达[30]。

3.2 嵌合VLPs 疫苗研究 虽然许多VLPs 用做疫苗已经取得成功，但对于可以直接干扰免疫细胞及能够成功逃逸宿主免疫防御系统的那些病原体而言，如HIV-1及HCV ，宿主感染了此类病毒很长时间都不能产生有效的免疫反应，推测此类病毒的VLPs 作为疫苗也会失败。因此，对此类VLPs 有必要进行适当的修饰改造。有些抗原不能够自身组装成VLPs ，有些抗原成分位于病毒颗粒内部，有些抗原分子很小、免疫原性差、半衰期短，使机体无法产生免疫反应，这都限制了此类抗原作为疫苗的研究。由于病毒结构蛋白亚基上有病毒装配的非关键区域，可将外源表位插入此处，而不影响病毒颗粒装配，由此可开发出嵌合VLPs 疫苗。嵌合VLPs 是以某种病毒的外壳或外膜结构作为VLPs 核心，通过基因工程手段在其上融合其它抗原表位，实现多价或多种病毒抗原的共同免疫。

HPV 早期蛋白6(Early Protein 6, E6) 和E 7的选择性表达或失活在病毒诱发的细胞恶变过程中具有重要意义，HPV 的致癌作用主要是通过E 6和E 7实现的，这两种蛋白在动物模型中可诱导机体产生具有抗肿瘤和抗病毒效应的细胞免疫反应[31]。因此，E 6和E 7可作为诱导肿瘤特异性CTL 反应的最佳靶抗原。有研究者将HPV L1 VLPs融合了HPV E6/E 7[32，33]，使HPV 非结构蛋白做为抗原呈现在VLPs 表面。实验表明，给小鼠注射低剂量含有HPV E7多肽的嵌合VLPs 可诱导小鼠的CTL 反应，而且可抵抗表达E 7的肿瘤细胞对小鼠的攻击[33]。

也可以在VLPs 核心上融合其它病原体的一种或多种抗原表位，如在HBcAg VLPs上整合流感病毒M 2[34]。有研究者将小鼠HIV 趋化因子受体5[Chemokine(CC) Receptor 5, CCR5]第一个外部环状结构与L 1融合表达，使CCR 5呈现在嵌合VLPs 的中和表位区域，产生的嵌合VLPs 可诱导小鼠产生高滴度的抗CCR 5抗体，这些抗体在体外可抑制HIV 与细胞受体结合[35]。HBcAg VLPs作为一种颗

粒性抗原，易被抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell, APC)摄取、加工、处理及呈递，能激发机体较强体液及细胞免疫应答。同时，HBcAg 具有直接激活B 细胞应答的作用，又具有激活T 细胞的表位，所以既是一种T 细胞依赖性抗原，又是一种T 细胞非依赖性抗原[36]。因此，可以通过嵌合或交联方式将外源抗原表位融合在HBcAg 蛋白上，这样外源抗原表位就呈现在HBcAg VLPs表面。

与抗原和佐剂分别进入细胞相比，抗原和佐剂进入同一个细胞能增强抗原的免疫原性[37]。如果VLPs 本身免疫原性不强，将佐剂连接在VLPs 表面则可以显著增强VLPs 疫苗的免疫效应。Wang BZ 等将由H 1N 1 HA、M 1组成的VLPs 嵌合了修饰后的沙门氏菌鞭毛蛋白，鞭毛蛋白可以发挥分子佐剂的功能。同非嵌合VLPs 相比，小鼠肌注嵌合VLPs 后，可获得更强的体液免疫和细胞免疫应答

[38]

。Kang SM等将霍乱毒素B 亚基(Cholera Toxin B

Subunit, CTB)交连在 SIV Gag及Env 蛋白上，小鼠免疫实验证明，注射含有CTB 的嵌合VLPs 效果明显优于单纯注射非嵌合的VLPs 或VLPs 与CTB 混合注射的方式[39]。

嵌合VLPs 疫苗作为一种新型疫苗，克服了传统疫苗的不足，是具有广阔发展前景的预防兼治疗的候选疫苗，为科学研究开辟了新的探索领域。4 VLPs作为载体的研究

在治疗性疫苗的研究中，选择高效、安全、特异的载体系统很关键。病毒衣壳蛋白一般具有碱性多肽域，这些碱性多肽域朝向颗粒的内表面，由于核酸的磷酸基团骨架呈负电荷，二者之间能形成一种高亲和性、非特异性的相互作用力。类似地，核酸以外的其它分子，只要带有合适的电荷，都能被包裹入VLPs 中或结合于其表面[40]，因此，VLPs 可作为基因或药物转移的载体。

Takamura S等使用戊型肝炎病毒VLPs 做为载体，包装编码HIV env 基因的质粒，小鼠免疫实验表明，该VLPs 可将质粒运载到小肠粘膜细胞中，并检测到Env120蛋白的表达，在血清和排泄物中可检测到高滴度抗HIV Env抗体[41]。

鼠多瘤病毒衣壳由三种不同蛋白(VP1、VP 2、VP 3) 构成双层结构，在病毒感染时，VP 1是宿主细胞膜上受体的主要配体，同时VP 1 N 端带有DNA 结合域和核定位序列[42]，因此，VP 1提供了靶向功能和药物结合位点，在基因治疗时可使用VP 1做为

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载体。VP 1蛋白与免疫球蛋白结合域融合表达，可构建出能够粘附抗体分子的VLPs 载体。May T将免疫球蛋白结合域插入VP 1，构建出VLPs ，将赫赛汀(Herceptin)[ErbB2受体蛋白酪氨酸激酶(ErbB2 Receptor Protein Tyrosine Kinase, ErbB2) 特异性抗体]粘附于免疫球蛋白结合域，这种VLPs 能特异性转染带有ErbB 2受体的细胞。由于VP 1具有结合DNA 的能力，所以可以构建出含有表达载体的VLPs ，使其定向在带有ErbB 2受体的细胞表达[43]。Weitkamp JH等将绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)整合到轮状病毒VP 2蛋白，与VP 6、VP 7蛋白共表达装配成VLPs ，此GFP VLPs可用于从人体细胞中区分轮状病毒特异性B 细胞[44]。Bergsdorf C等将HPV 16的L 1或L 2蛋白用荧光素底物标记构建的VLPs ，为研究病毒与细胞的相互作用提供了帮助[45]。

5 VLPs在免疫学检测中的应用

病毒感染动物后可刺激机体产生针对病毒各种抗原表位的抗体，病毒的衣壳蛋白或包膜蛋白上可能存在着优势抗原表位。衣壳蛋白或膜蛋白组装成VLPs 后，可以作为抗原对抗体进行检测。由于衣壳蛋白或膜蛋白组装成VLPs 后，通过各亚单位之间的相互作用可以形成单个蛋白不具有的立体构象，因此相对于单个病毒蛋白，使用VLPs 对抗体进行检测具有更高的灵敏度和特异性。

HPV 有100多种亚型，对亚型的检测十分重要，而HPV 不易体外培养与分离，使用合成肽或重组蛋白作为抗原检测抗HPV 抗体的敏感性和特异性都不高。使用基因工程制备HPV VLPs解决了这一问题，以HPV VLPs作抗原，通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测HPV 患者血清中的抗体，与HPV DNA检测结果一致[46]。

VLPs 具有类似天然病毒的结构，具有很强的免疫原性，以VLPs 免疫动物可以获得高滴度的抗体。这种抗体可以用于相应病毒的免疫学检测。Graham DY等将NV VLPs免疫动物获得抗体，通过ELISA 检测NV 感染者粪便中的病毒，具有较高的特异性和灵敏性[47]。6 问题与展望

组装VLPs 有时需要几种蛋白，表达不同蛋白的重组载体进入同一细胞的概率较小，降低了各蛋白之间的相互作用机会和VLPs 组装机率。而构建

多基因共表达载体难度较大，且同一载体上各基因的表达比例不易控制。某些蛋白可能对表达细胞具有毒性，不利于表达，从而降低VLPs 的形成。多价VLPs 疫苗具有很多优点，但多价疫苗各组分之间的量效关系较复杂。嵌合VLPs 在应用中也存在局限，如果核心VLPs 较小，不易融合较大的外源抗原蛋白。另外，多抗原表位呈现需了解各表位分子之间的相互作用，但目前尚缺乏足够的研究基础。虽然已使用多种表达系统成功构建了VLPs ，但在如何有效放大工艺水平、提高VLPs 组装效率、降低成本等方面仍面临许多挑战。

鉴于VLPs 与天然病毒结构的相似性、不感染宿主的安全性、良好的结构稳定性、出色的免疫原性，以及良好的结构可塑性、独特的承载DNA 及其它分子的能力，VLPs 相关技术在生物医学基础研究、新型疫苗开发、新型药物递送载体开发及基因治疗中具有广阔的应用开发前景。

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