生化免疫技术----免疫血清的制备及效价测定

免疫血清的制备及效价测定

制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。

制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。

测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。

第一部分、免疫血清的制备

我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG 抗体的制备。

Ig 是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。可以刺激异种动物产生抗Ig 血清，经适当提取后，产生抗Ig 抗体，又叫第二抗体或抗抗体。在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig 抗体。

【实验材料】

1．动物IgG（兔源的，购买）

2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂

3．青霉素和链霉素

4．实验动物： BALB/c小鼠

5．无菌 1ml 注射器

6. 生理盐水，酒精棉等

【实验步骤】

1. 免疫程序：

40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。

2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。

第二部分、免疫血清质量评价

一、 效价测定

抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法

—）、琼脂扩散法

1.操作步骤（具体见附注）

⑴ 做琼脂板，打梅花孔。

⑵ 将血清倍比稀释，加入外周孔，中间孔加动物Ig。

⑶ 37℃湿盒琼扩24小时，观察结果。

2.结果判定

⑴ 抗Ig 的效价测定： 琼脂扩散效价达1﹕16或1﹕32者为合格。

⑵ 纯度鉴定： 采用琼扩法。中间孔加抗Ig 血清，外周孔加Ig 和标准品Ig。在抗Ig 与Ig 以及标准品Ig 均出现一条沉淀线，且这两条沉淀线相互融合者，说明提取的Ig 是纯的。

二）、ELISA法抗体效价测定---间接法（具体见附注）

包被抗原浓度： 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升

二、特异性测定（暂不做）

抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常，特异性是以交叉反应率来表示的。交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50时的浓度，按下列公式计算交叉反应率。

S=y/Z×100%

S：交叉反应率，y：IC50时抗原浓度，Z：IC50时近似抗原物质的浓度。 如某抗原的IC50浓度为90Pg/管，而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大，可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。

三、抗体保存

一般4℃，长期-20℃或冻干。避免反应冻融。

四、注意事项

1. 动物免疫时注意确保抗原被注射到了腹腔中,要避免注入其他脏器（如肠、膀胱）内。

2. 稀释血清时尽量做到精确。

五、思考题

1. 影响免疫血清质量的因素有那些？

2. 各种检测抗体效价的方法相比有什么优缺点？

六、免疫失败的可能原因及应采取的措施

有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。

1.免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。

2.抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。

3.制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。

4.所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。

5.免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。

6.动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。

附注：

琼脂双扩

【原理】

抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。

【材料】免疫血清，小牛血清，免疫前血清，抗原，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。

【方法】

1、用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml 趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。

2、待琼脂凝固后，用打孔器打孔成梅花形，并用针头挑去孔中琼脂 （孔距为5mm）。 如下图：

3、在图中A 部分，加倍比稀释的血清入外周孔，中间孔加动物Ig。

若做特异性检测，可在B 部分，①孔中加免疫前血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加免疫血清，注意不要溢出。

4、将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

【结果】

观察孔间沉淀线的数目与特征，一般可注意到以下几种现象：

1、抗原与抗体孔间形成一条沉淀线，说明只有一种抗原与相对应的抗体特异性结合，如出现数条沉淀线，说明有几组不同的抗原和相对应抗体相结合。

2、根据抗原的成份可有以下三种现象：（1）若二孔中的抗原相同，与相应抗体形成的沉淀线融合成弧形；（2）若二孔中抗原不同，当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时，则形成的沉淀线相交叉；（3）若两孔中抗原部分相同，抗血清中有各相应的抗体，形成的沉淀线相切。

3、相应抗原抗体所形成的沉淀线，如二者浓度相当，沉淀线在孔中央，二者浓度不当时，则沉淀线偏向浓度低的一侧。