microRNAs表达载体的构建
microRNAs表达载体的构建
实验目的
利用表达载体或RNA干扰载体实现microRNA的过表达或异位表达。 实验原理
microRNA所在的基因组片段在载体启动子的介导下在细胞内转录形成包含pre-microRNA在内的RNA片段，依靠细胞内microRNA的加工机制形成成熟的microRNA, 从而发挥其生物学功能。
实验过程
1. microRNA所在基因组片段的获取
通过miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml)明确一个或一簇特定microRNA在基因组上的位置，从而利用基因组序列的公共数据库ensembl ()得到成熟microRNA及其侧翼的碱基序列。 具体步骤为：miRBase>特定microRNA>view flanking feature>flanking coordinates>export data.
2. microRNAs表达载体的构建
成熟microRNA上下游至少分别延伸125 bp的片段经特定的限制酶切位点克隆到表达载体或RNA干扰载体。
典型例子—microRNA-223表达载体的构建
microRNA-223的生物学功能因在造血系统中被阐释而受到广泛关注，其对粒细胞的分化和成熟发挥着重要的调控作用。本实例旨在将人基因组中编码microRNA-223的片段定向克隆到逆病毒表达载体pMSCVpuro上，实现体外研究microRNA-223功能的需要。
1. 确定microRNA-223及其侧翼的序列信息
登陆miRBase搜寻mir-223，然后点击hsa-mir-223即可获得包括microRNA-223、pre-microRNA-223及其侧翼的序列信息等，通过view flanking features选项链接到ensembl数据库即可获得microRNA-223及其侧翼的序列（加粗碱基即microRNA-223
的序列）：
AGGATCTCTCTTCTGGTTAGGAACCCTATGCCTATTTTGCTCACTTCCCTATTCACACACCATGAGAGTGCTGATGGGGGCGCAATAGTCTTGAAAATGTA；
2. 附加特定限制酶切位点的microRNA-223前体片段的获取
鉴于病毒载体pMSCVpuro的多克隆位点包含四个限制酶切位点，即BglⅡ、XhoⅠ、HpaⅠ和EcoRⅠ,故对上述microRNA-223及其侧翼序列的限制酶切位点做出分析，结果表明，该片段中包含BglⅡ识别位点，但不包含XhoⅠ、HpaⅠ和EcoRⅠ识别位点，故分别设计包含XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点的上下游引物microRNA-223-XhoⅠ-F (CCTCTCGAGGTGCTTTGGTTGGTCCTTTG)和microRNA- 223-EcoRⅠ-R (ATAGAATTCACTTTTCCCCTGGTGTCCTC)，通过聚合酶链式反应即获得附加特定限制酶切位点的microRNA-223前体片段，即上述microRNA-223及其侧翼序列中加的下划线部分；
3. 附加特定限制酶切位点的microRNA-223前体片段与载体的连接反应
体外利用T4连接酶将纯化的附加特定限制酶切位点的microRNA-223前体片段与载体连接，经随后的转化和鉴定即完成microRNA-223表达载体的构建。 实验注意事项
1. 包含microRNA的基因组片段克隆到载体的方向一定要与基因组中microRNA的转录方向一致；
2. 构建载体时microRNA上下游分别延伸的长度以能够满足细胞内microRNA加工成熟的需要为标准，考虑到进行细胞转染或感染的效率，microRNA上下游分别延伸的长度不宜过长，一般认为各延伸125 bp即可 [Chang-Zheng Chen et al., 2004 ]。 参考文献
Chang-Zheng Chen, Ling Li, Harvey F. Lodish, David P. Bartel. (2004). MicroRNAs Modulate Hematopoietic Lineage Differentiation. Cell 303, 83-86.