用SDS凝胶电泳法测定水解丝蛋白的分子量_吴斗思

　　　　天津纺织工学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第15卷第4期(1996)JOURNALOFTIANJININSTITUTEOF　　　　　　　　　　　　　　　Vol.15　No.4(1996)TEXTILESCIENCEANDTECHNOLOGY　　　　　　　　　　　　　　　　SUM　No.　51　　

用SDS凝胶电泳法测定水解丝蛋白的分子量

吴斗思　卢淑琴　吴献役

(天津纺织工学院材料科学系　　天津300160)

摘要:低分子量水解丝蛋白对皮肤有良好的保湿作用和保香效果,是高级洗发、护肤化妆品的优质添加剂.本文作者用改进的SDS凝胶电泳法对丝素课题组实验室生产的水解丝蛋白产品的分子量进行了测定,测定表明该产品分子量分布在43000-2900范围,分子量在10000以下的低分子蛋白成份含量高于50%,品质上好,可用于工业产品生产.

关键词:SDS凝胶电泳法,水解丝蛋白,分子量测定

Determinatingmolecularweightsofsilk'sprotein

hydrolysatebySDS-condensedgumelectrophoresis

WuDousi　LuShuqin　WuXianyi

(Dept.ofMater.Sci.)

Abstract:Themolecularweightsofthesilk’spreteinhydrolysatepreparedin

thelaboratoryweredeterminatedbySDS-condensedgumelectrophoresis.Theex-perimentalresultsshowthatmolecularweightdistributionofthesamplesisbetween43000-2900andsmallmolecule(below10000)contentsaremorethanhalf.

’sproteinhydrolysate,molec-keywords:SDS-condensedgumelectrophoresis,silk

ularweightdetermination

0　前　　言

蚕丝的主要成分是丝素和丝胶,其含量分别是70-80%和20-30%.除丝素和丝胶外还有其他物质,如蜡、碳水化合物、色素和无机成份等,这些物质含量很少,加起来也只有1-2%.丝素和丝胶都是蛋白质,通常所说的蚕丝蛋白质指的就是丝素和丝胶.丝素是一种纤维蛋白质,不溶于水,丝胶是一种球状蛋白质,溶于水.每根蚕丝是由两根单丝平行粘合而成,每根单丝的中间为丝素纤维,外围为丝胶.因丝胶溶于水,在中性丝光皂溶液中煮沸便可脱除.

构成丝素的基本单元是氨基酸,各种氨基酸由肽键结成肽链,再由肽链构成丝素蛋白质.丝素虽不溶于水,但与水接触时能吸收一定量的水引起体积膨胀,丝素吸水增加的重量可达30-35%,体积膨胀程度可达30-40%.丝胶含亲水基团的氨基酸比丝素多且丝胶结构不紧密、孔隙多,水分子更易进入.所以丝胶的吸水性比丝素大许多.

收稿日期:1996-05-13;　吴斗思,男,51岁,副教授.23

1996年　　　　　　　　　　天　津　纺　织　工　学　院　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　酸和碱都会促使丝素水解,水解程度主要决定于溶液的pH值、处理的温度和时间等因素.丝素在中性盐如NaCl、NaNO3等的稀溶液中发生的膨润与在水中相似,但在某些盐类如Li、Sr、Ba的氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐及氯化锌的浓溶液中却能无限膨润而成为粘稠溶液.另外,在一些配合物盐溶液中如铜氨溶液、镍氨溶液及铜乙二胺溶液中丝素也会因配合作用而发生溶解.

蚕丝中的丝素蛋白具有特殊的蛋白螺旋结构,与自然的保湿原子(NMF)相近似,对皮肤有良好的保湿作用和保香效果.随着人们生活质量的提高和消费的需要,丝素蛋白质在日化领域得到了较好的开发,用丝素蛋白作为特殊功用添加剂制造的膏、霜、露、液等洗发、护肤化妆品受到消费者的普遍喜爱.用于化妆品的优质丝素蛋白质应是分子量在10000以下的小分子水解蛋白,因小分子量蛋白可被毛发吸收,起到营养毛发等作用.我们课题组对丝素水解进行了研究并对水解丝素产品进行了分子量测定.

蛋白质分子量测定方法有超速离心法、凝胶过滤色谱法等,而较多用的是SDS凝胶电泳法,这种方法最适宜测定分子量是15,000-100,000的样品,对低于10,000分子量的水解蛋白不太适用,通过改进,用强电解质离子为前导离子和拖尾离子可对分子量低于10,000的水解蛋白(多肽)样品进行分子量测定.

1　用SDS凝胶电泳法测定蛋白质分子量的理论依据

蛋白质分子可以用通式PNH2COOH表示,羧基可给出H、氨基可接受H,故蛋白质具

+-+有两性性质,蛋白质中的羧基和氨基可互相作用形成双极离子PNH3COO.在H浓度大的

+-++-溶液中PNH3COO+H PNH3COOH,蛋白质以正离子存在;而在OH浓度大的溶液中++

PNH3COO+OH PNH2COO+H2O,蛋白质以负离子形式存在.若溶液的pH值为某一数值时蛋白质以中性的双极离子形式存在,这个pH值称为蛋白质的等电点.等电点时因蛋白质分子整体上不带电,所以在电场中不会移动.

带电蛋白质分子在电场作用下将作定向移动,其移动的速度可表示为:

　　　　　　　V=6πγηd

:分子(或离子)所带净余电荷,E:两电极间电位差,d:两电极间距离,γ:球形分子的半q

径,η:溶液的粘度

从上述关系式可知,在其他条件(电场、介质粘度等)不变的情况下,蛋白质在凝胶中的迁移速率受分子所带净电荷量与分子大小两个因素的影响.如果两种不同分子量的蛋白质的分子大小的差异被所带净电荷量的差异所补偿时,则这两种不同分子量的蛋白质可以相同的速率电泳,这将无法通过电泳距离测定蛋白质的分子量.为了解决这一问题,人们经过长期的研究发现,在SDS(十二烷基磺酸钠)存在下蛋白质的电泳速率和它们的分子量的对数成直线关系.其理由是SDS能与蛋白质的疏水区相结合并把绝大部分蛋白质分离成它们的组成亚单位.SDS的结合还使变性的、随机盘曲的多肽链得到大量负电荷,这种电荷基本上掩盖了无SDS存在时正常带有的任何电荷,就是说,使不同大小分子量的蛋白质都带上基本相同的电荷,所以使得蛋白质分子的电泳速率和分子量的大小有了一定的关系,分子量大,泳动迁移率小;分子量小;迁移率大,具体为lgM～d直线关系.

在用SDS凝胶电泳法测定蛋白质分子量时需同时至少用3-4种标准蛋白质,这几种蛋+-+-

　　　　　　　　吴斗思等:用SDS凝胶电泳法测定水解丝蛋白的分子量　　　　　　　　　第4期白质的分子量有的应高于待测蛋白质;有的应低于待测蛋白质,使待测蛋白质夹在标准蛋白质中间,从标准蛋白质得到的直线上就能找到待测蛋白质的适当位置,从而确定其分子量.

实际进行电泳时的泳槽有圆盘电泳槽、板电泳槽.我们选用板凝胶电泳槽,此种电泳槽的优点是便于对多种实验样品进行比较,因为所有的样品都存在于同一凝胶中,各样品的电泳条件是完全一致的.另外,操作起来简便,易于进行染色、脱色等泳后过程.

2　实验部分

2.1　仪器

夹心式垂直电泳槽配套装置

2.2　药品

2.2.1　分离胶缓冲液

1M三羟甲基氨基甲烷(Tris),0.2%SDS,浓H2SO4调至pH=7.8

2.2.2　分离胶储存液

17.1g丙烯酰胺,0.9gN,N′-甲叉双丙烯酰胺,加蒸馏水至体积为50ml,过滤备用.

2.2.3　样品缓冲液

1%SDS,8M尿素,1%巯基乙醇,0.01M磷酸,用Tris调至pH=6.8,滴入数滴1%的溴酚兰溶液.

2.2.4　上下槽电泳缓冲液

7.8gNaH2PO4·H2O,18.6gNa2HPO4,2gSDS,用蒸馏水配成最终体积2000ml,pH=7.2

2.2.5　染色液

1.25g考马斯亮兰,227ml甲醇,46ml冰醋酸,227ml蒸馏水

2.2.6　脱色液

50ml甲醇,75ml冰醋酸,875ml蒸馏水

2.2.7　凝胶保存液

7.5ml冰醋酸,92.5ml蒸馏水

2.2.8　2.4%过硫酸铵溶液,用时新配制.

2.3　实验操作

2.3.1　制胶

取尿素9.6g加3.2ml药品液(2.2.1)7.1ml药品液(2.2.2),加约2-3ml蒸馏水,搅拌至尿素完全溶解(可适当加温促尿素溶解),然后加8mlTEMED、0.5ml药液(2.2.8),最后体积用蒸馏水补充到20ml,溶液立即倾入制胶模板中(1.5mm模板),嵌入梳形样品槽模具,待模板中的胶定型后(30-60分钟),轻轻取出梳形样品槽模具,完成采用连续电泳法制胶过程.

2.3.2　电泳

分别取适量样品溶于样品缓冲液中,用微量进样器取样5-10μl,加入样品槽中,同时还要加标准样品和溴酚兰染料指示样品.加样完成后立即通电,电流控制在20-50mA.等到溴酚兰染料前沿达分离胶底部时停止电泳.

2.3.3　显色

电泳完成后立即取出凝胶并在染料前沿做标记,然后直接将胶浸入染色液中染色,染1小时左右,取出凝胶浸入脱色液中脱色,直至凝胶本底色带清晰.25

1996年　　　　　　　　　　天　津　纺　织　工　学　院　学　报　　　　　　　　　　　　　　3　结果和讨论

一共进行了30余次制胶电泳实验,测定了近百个不同实验条件下生产的样品.因为每次电泳实验的条件会略有不同,所以每作一个或几个样品,必须同时作标准样品,以便根据标准样品画出lgM-d直线确定待测样品的分子量.

图1显示的是一次电泳实验结果.凝胶厚度1.5mm,电泳电流20mA,全程电泳时间6小时25分.胶槽5加的是标准蛋白样品,分子量组成是94000、67000、43000、17500,电泳迁移的距离(泳距)分别为3mm、7mm、17mm、31mm(由于标准样蛋白量较少,故凝胶上蛋白显色较淡,凝胶实物经复印成图片后又因碳黑阴影的掩蔽使得复印图1上色调更浅).胶槽2加的是待测样品,电泳后形成一个长度为32mm的色带,上端泳距18mm,下端泳距50mm.胶槽3加的是药用胰岛素参考样品,泳距41mm.胶槽9加的也是药用胰岛素参考样品,只是比槽3晚加了55分钟,实际电泳时间是5小时30分钟.槽10是后加的同槽2相同的样品,电泳时间40分钟.槽12是后加的又一待测样品,电泳时间40分钟

.

图1　电泳凝胶复印件　　　　　　　　　　　　　　　　　图2　标准蛋白lgM-d关系

　　　　　　　　(凝胶厚度1.5mm)

图2是根据图1提供的数据画出的标准样的lgM-d图.待测样品色带的上、下端位置分别用↑、↓标在lgM-d直线上,对应的分子量分别是43000和2900.即是说丝素水解蛋白样品的分子量分布在43000-2900范围.这个结果是符合丝素水解实际情况的.蛋白质是由氨基酸组成的,经水解可以成为分子量较小的系列中间产物直至氨基酸,水解过程的各中间及最后产物如下:蛋白质→(蛋白)月示→(蛋白)胨→肽→氨基酸.在一定水解条件下得到的丝素水解产物实际上是各中间产物和最终产物组成的混合体.

用于化妆品的丝素水解产品应以生成更多的肽产物为宜,但这时也往往易水解过度而生成太多的氨基酸,因此掌握好水解条件和水解时间是极重要的.

用本实验方法测定丝素水解样品的分子量分布结果基本是稳定可信的,改变部分实验条件重复实验,对同一待测样品能得到大致相同的分子量分布结果.

本课题组实验室制得的丝素水解产品中低分子蛋白成份(分子量在10000以下)占50%多,可用作高级化妆品的优质特种添加剂.

参考文献

1　AndersonBLetal,AnalBiochem,1987,132:365

2　阿伯特·莱特(美),张维钦译.蛋白质的结构与功能.北京:高等教育出版社,1984