工业微生物菌种的衰退.复壮与保藏

⒈ 菌种衰退的原因

菌种衰退的原因有两个方面：一是菌种保藏不妥；二是菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。

菌种的衰退会使微生物个体和群体特征的各个方面发生变化，其中最重要的是使所需产物的生产产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件的性能减弱等。菌种的退化不同于培养过程中由环境条件变化引起的表面的、暂时的变化，而是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株衰退的一个从量变到质变的遗传变异过程。

菌种连续传代是菌种发生衰退的直接原因。由于连续传代使菌种经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是在不断地变化，与处于休眠状态的菌种相比，细胞的自发突变率要高得多。因此，菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。培养基灭菌升、降温的不同，培养基存放时间的不同，采用老龄菌和多核菌丝传代等都比较容易引起菌种衰退。

菌种的保藏主要是通过控制低温、干燥、缺氧等条件，使微生物营养体或休眠体处于不活泼的状态，维持最低代谢水平，尽可能保证活力和不发生变异。但是，各种菌种的保藏法对阻止菌种变异的效果不尽相同，用效果较差的条件保藏菌种时，菌种就较易发生衰退。此外，保藏操作不当也会影响保藏效果，甚至导致菌种的变异。

菌种自身突变引起菌种衰退。菌种的自发突变和回复突变是引起菌种自身衰退的主要原因。微生物细胞在每一世代中的突变概率一般为10-8～10-9，保藏在0～4 ℃时这一突变概率更小，但仍然不能排除菌种衰退的可能。诸如对营养缺陷型菌种未充足供给所需营养物，菌种就会发生突变而丧失已有的特性。

菌种的回复突变是指突变菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得的优良性状的退化。

突变不完全造成菌体遗传组成的差异。对于单核细胞的菌株，菌体内的DNA双链中仅有一条链发生位点突变，并复制成变异菌的DNA链，而未发生变化的一条链，复制成原菌的DNA链，结果形成不纯的菌落，经移植后表现出菌种的衰退现象。同样，对于具有两个核以上细胞的菌株，如果只有一个或几个核发生变异，将会产生异核菌丝，不纯的异核菌丝分裂，便会形成性状不同的菌丝，而一旦性状不同的菌丝占优势，就将表现出菌株的衰退，而不再具有优良的性状。

如果菌落不是由一个孢子或一个细胞形成，当其中只有一个高产突变的孢子或细胞，通过移植后，高产菌株数量就比较少，表现出菌种衰退。

⒉ 菌种性能的改变

⑴ 菌种遗传特性的改变 从菌种遗传机理这一微观角度来看，菌种遗传特性的改变主要有如下三个原因。

① 异核现象导致微生物群体发生变异。某些菌丝生长时会和邻近的菌丝细胞间发生吻合，形成异核菌丝体(简称异核体)，即在一条菌丝里含有几个遗传特性不同的细胞核，共同生活在均一的细胞质里。异核体可以由遗传性不同的菌丝吻合后形成，也可由多核菌丝中个别核发生突变而产生。异核体所产生的单核或多核的孢子具有不同的遗传特性和不同的生长繁殖速度，其结果是伴随着菌种传代培养，菌种的遗传特性发生改变。在菌种选育过程中，许多从培养基中新分离出来的丝状菌是异核体。在抗生素生产中，从产生单核分生孢子的异核体进行单孢子自然分离，可以得到同核的单菌落，其中很多表现出稳定的生产能力。

② 自发突变导致菌种遗传特性改变。由于DNA在复制过程中会出现偶然的差错，以及环境中某些物质和某些微生物自身的代谢产物对微生物有刺激作用，菌种以很低的频率发生自发突变。

③ 突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种往往不稳定，容易发生回复突变或产生分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型（亦称遗传型）的个体。

以上是导致菌种变异的遗传因素，这些因素将通过环境得以表现。生产菌种在使用过程中，需要在人工培养条件下进行传代，虽然原始斜面菌种是由单菌落发育而来，但菌落上的许多分生孢子已经具有不同的遗传基础，所以菌种的性状实际上是孢子群体的特征。较纯的群体，传代后变异较少；不纯的群体，传代后变异较多。在菌种传代培养过程中，导致菌种遗传特性改变的以上几个原因都可起作用，其结果使群体中变异菌株增多。传代培养还具有某种选择作用。通常所说的菌种优良性状和大量生成目的产物的有关的高产菌株往往表现出生活力弱、生长繁殖速度慢的特点。这些特点使得传代培养实质上具有富集低产菌株的作用。所以，菌种传代次数过多会导致菌种衰退。此外，菌种保藏条件不当也会使菌种发生变异。在菌种保藏过程中采用的一些手段，例如冷冻干燥，会对菌体细胞的结构和DNA造成损伤，在修复这些损伤时，菌体就可能发生变异。

⑵ 菌种生理状况的改变　菌种的遗传特性需要在一定条件下才能表现出来。由于培养条件不适当，使菌种处于不利于发酵生产的生理状况，其结果也表现为菌种衰退。菌种处于不利于发酵的生理状况有以下三个方面的原因。

① 一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。一个由单菌落发育而来的菌种在固体培养基上分离，可以长出许多种形态培养特征的菌落。这些不同的菌落类型在代谢和生长繁殖速度等方面有一定差异。培养条件可以影响各变异株在培养物中的比例而改变该菌种的特性。同一个菌种的单孢子分离在不同的培养基上，所生长出的单菌落，其形态培养特征有显著差异，各种类型菌落所占的比例也不同。如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)在豌豆琼脂培养基上，单孢子分离呈现出3～4种菌落类型，而在黄豆粉培养基上仅出现两种菌落类型。在开始菌种选育工作时，要研究单菌落的分离培养基，找出能呈现较多菌落类型的分离培养基。菌落类型和发酵产量之间存在着某种程度的相关性。在选种实践中，人们经过对菌落形态的考察，有意识地丢弃一些被认为是低产的菌落，挑选那些可能是高产的菌落。

② 菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，因而影响发酵。菌种培养基营养贫乏也同样不利于发酵。因为菌种在营养贫乏的培养基中多次传代，会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰老甚至死亡。因此，自然选育或菌种培养所用的培养基应选择具有菌种传代后生产能力下降不明显、菌体不易衰老和自溶的正常形态菌落、孢子丰富的培养基。

③ 在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变。这种改变可能以类似于生理性迟延或细胞分化的机制保持较长一段时间。

由于菌种的衰退将会引起发酵过程的产量急剧下降，一旦发生菌种衰退，就必须采取有效的预防和防治措施，防止菌种的优良性状发生退化。同时若发现某些优良性状退化，应及时进行分离纯化，使生产菌种保持稳定的优良特性。防止菌种衰退的措施主要有菌种的复壮、提供良好的环境条件、定期纯化菌种、防止自身突变等各个方面。

⒊ 防止菌种衰退的措施

要防止菌种衰退，应该作好保藏工作，使菌种优良的特性得以保存，尽量减少传代次数。如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进行分离复壮。

⑴ 菌种的分离　菌种发生衰退的同时，并不是所有的菌种都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的、具有更强生命力的菌体。因此，采用单细胞菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞所长成的菌落，再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来性状的菌株，甚至性能更好的菌株。如对芽孢杆菌，可先将菌液用沸水处理几分钟，再用平板进行分离，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。如果遇到某些菌株即使进行单细胞分离仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，达到复壮的目的。如AT3.942栖土曲霉的产孢子能力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。同时通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。

菌种分离方法如下：

① 配合一定的培养条件，对退化菌株进行单菌落或单细胞分离，淘汰退化的个体，保留纯化菌种。

② 将芽孢杆菌的悬液加热至90 ℃处理数分钟，杀灭已退化的菌体，保留芽孢；再将芽孢或孢子进行传代，以淘汰退化的个体。

③ 提供特殊的培养条件，使环境有利于优良性状菌株的生长而不利于退化菌株的生长，从而淘汰已退化的菌株个体。

④ 将分离后得到的初筛菌株先保藏，再进行复筛考察，从中选出稳定性较好的菌种。

⑤ 同时应用上述方法中的两种或两种以上的方法，会收到更好的复壮效果。

⑵ 菌种的复壮　菌种的复壮有狭义的复壮和广义的复壮。狭义的复壮指的是菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。而广义的复壮应该是一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高，所以，这实际上是一种利用自发突变(正突变)从生产中不断进行选种的工作。

⑶ 提供良好的环境条件　进行合理的传代，减少传代次数可防止由于菌种的遗传稳定性变化而引起的自发突变，以及由于环境条件变化导致的退化。菌种允许使用的传代次数必须通过传代的稳定性试验确定。发酵生产上一般只用三代内的菌种。采用合适的传代条件使培养条件有利于高产菌的生长，而不利于低产菌的生长，减少突变的发生。

⑷ 用优良的保藏方法　尽可能采用诸如斜面冰箱保藏法、砂土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法以及采用干孢子保藏等优越的保藏方法保藏菌种，以防止菌种的衰退。

⑸ 定期纯化菌种　对菌种进行定期的分离纯化，可减少其中共存的自发突变菌或“突变不完全”产生的退休型菌株的增殖机会，保持原来的优良特性。诸如对营养缺陷型菌种在纯化过程中提供足够的营养物，以保持菌株的优势，避免回复突变体的竞争。同样在进行抗性突变的菌种纯化时在培养基中加入对应于抗性的药物，可保持菌株的抗性优势，避免产生无抗性的回复突变体。

采用遗传性稳定的菌体作为菌种、合适的培养基传代等可减少和防止菌种的自身突变。

菌种的复壮

⑴ 纯种分离　通过纯种分离，可把退化菌种中的一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌株的典型性。常用的菌种纯化方法很多，大体上可把它们归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平上来说是纯的，例如在琼脂平板上进行划线、表面涂布或与琼脂培养基混匀以获得单菌落等方法；另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法，它可以达到“细胞纯”即菌株纯的水平。后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室，也有利用复杂的显微操纵器的菌株分离方法。如果遇到不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端以截取单细胞而进行纯种分离。

⑵ 通过寄主体进行复壮　对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动物寄主体内以提高菌株毒性。如经过长期人工培养的杀螟杆菌，会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，这时可将衰退的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。

⑶ 淘汰已衰退的个体　有人曾对“5406”菌种采用在低温(-30～-10 ℃)下处理其分生孢子7天，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。

以上综合了在实践中收到一定效果的一些防止衰退和达到复壮的措施。但是，在使用这类方法之前，还要仔细分析和判断菌种究竟是衰退、污染还是仅属一般性的表型改变，只有对症下药才能使复壮工作奏效。

菌种的保藏

一个优良的菌种被选育出来以后，要保持其生产性能的稳定、不污染杂菌、不死亡，这就需要对菌株进行保藏。

⒈ 菌种保藏的原理

菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。保藏时，一般利用菌种的休眠体(孢子、芽孢等)，创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到方法经济、简便。由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，要根据具体情况而定。

⒉ 菌种保藏方法

⑴ 斜面低温保藏法　本方法是利用低温降低菌种的新陈代谢，使菌种的特性在短时期内保持不变。将新鲜斜面上长好的菌体或孢子，置于4 ℃冰箱中保存。一般的菌种均可用此方法保存1～3个月。保存期间要注意冰箱的温度，不可波动太大，不能在0 ℃以下保存，否则培养基会结冰脱水，造成菌种性能衰退或死亡。

影响斜面保存时间的突出问题是培养基水分蒸发而收缩，使培养基成分浓度增大，造成“盐害”，更主要的是培养基表面收缩造成板结，对菌种造成机械损伤而使菌种致死。为了克服斜面培养基水分的蒸发，用橡皮塞代替棉塞，有比较好的效果，也可克服棉塞受潮而长霉污染的缺点。有人将2株枯草杆菌、1株大肠杆菌和1株金黄色葡萄球菌，分别接种在18×l80 mm试管斜面上，当培养成熟后将试管口用喷灯火焰熔封，置于4 ℃冰箱中保存了12年后，启封移种检查，结果除1株金黄色葡萄球菌已死亡，其余3株仍生长良好，这说明对某些菌种采用这种保藏方法，可以保存较长的时间。

⑵ 液体石蜡封存保藏法　在斜面菌种上加入灭菌后的液体石蜡，用量高出斜面1 cm，使菌种与空气隔绝，试管直立，置于4 ℃冰箱保存。保存期约1年。此法适用于不能以石蜡为碳源的菌种。液体石蜡采用蒸汽灭菌。

⑶ 固体曲保藏法　这是根据我国传统制曲原理加以改进的一种方法，适用于产孢子的真菌。该法采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体(孢子)后加以保存。该法的要点是控制适当的水分。例如在采用大米保藏孢子时，先取大米充分吸水膨胀，然后倒入搪瓷盘内蒸15 min(使大米粒仍保持分散状态)。蒸毕，取出搓散团块，稍冷，分装于茄形瓶内，蒸汽灭菌30 min，最后抽查含水量，合格后备用。将要保存的菌种制成孢子悬浮液，取适量加入已灭菌的大米培养基中，敲散拌匀，铺成斜面状，在一定温度下培养，在培养过程中要注意翻动，待孢子成熟后，取出置冰箱保存，或抽真空至水分含量在10％以下，放在盛有干燥剂的密封容器中低温或室温保存。保存期为1～3年。

⑷ 砂土管保藏法　本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于产孢子的放线菌、霉菌以及产芽孢的细菌。砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为3:2或1:1，将黄砂和泥土分别洗净，过筛，按比例混合后，装入小试管内，装料高度约为1 cm左右，经间歇灭菌2～3次，灭菌烘干，并作无菌检查后备用。将要保存的斜面菌种刮下，直接与砂土混合；或用无菌水洗下孢子，制成悬浮液，再与砂土混合。混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器中，用真空泵抽气干燥后，放在干燥低温环境下保存。此法保存期可达1年以上。

⑸ 冷冻干燥法　此法的原理是在低温下迅速地将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因而能长期保存，一般为5～10年。此法适用于各种微生物。具体的做法是将菌种制成悬浮液，与保护剂(一般为脱脂牛奶或血清等)混合，放在安瓿内，用低温酒精或干冰(-15 ℃以下)使之速冻，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿真空熔封，低温保存备用。

⑹ 液氮超低温保藏法　前面几种菌种保藏方法，在保存过程中菌种都有不同程度的死亡，特别对一些不产孢子的菌体保存的效果不够理想。微生物在-130 ℃以下，新陈代谢活动停止，这种环境下可永久性保存微生物菌种。液氮的温度可达-196 ℃，用液氮保存微生物菌种已获得满意的结果。液氮超低温保藏法简便易行，关键是要有液氮罐、低温冰箱等设备。该方法要点是：将要保存的菌种(菌液或长有菌体的琼脂块)置于10％甘油或二甲基亚砜保护剂中，密封于安瓿内(安瓿的玻璃要能承受很大温差而不致破裂)，先将菌液降至0 ℃，再以每分钟降低1 ℃的速度，一直降至-35 ℃，然后将安瓿放入液氮罐中保存。

⒊ 菌种保藏的注意事项

菌种保藏要获得较好的效果，需注意如下三个方面：

⑴ 菌种在保藏前所处的状态　绝大多数微生物的菌种均保藏其休眠体，如孢子或芽孢。保藏用的孢子或芽孢等要采用新鲜斜面上生长丰满的培养物。菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短，保存时容易死亡；培养时间长，生产性能衰退。一般以稍低于最适生长温度下培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。

⑵ 菌种保藏所用的基质　斜面低温保藏所用的培养基，碳源比例应少些，营养成分贫乏些较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强，影响保藏时间。砂土管保藏需将砂和土充分洗净，以防其中含有过多的有机物，影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒的物质。冷冻干燥所用的保护剂，有不少经过加热就会分解或变性的物质，如还原糖和脱脂乳，过度加热往往形成有毒物质，灭菌时应特别注意。

⑶ 操作过程对细胞结构的损害　冷冻干燥时，冻结速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。真空干燥程度也将影响细胞结构，加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。细胞结构的损伤不仅使菌种保藏的死亡率增加，而且容易导致菌种变异，造成菌种性能衰退。