中_美_英_日四国药典中胰岛素质量标准的比较

药物分析杂志Chin J Phar m Anal 2009, 29(11)

3

—1969—

中、美、英、日四国药典中胰岛素质量标准的比较

张歌, 董婧, 汤玥, 朱家壁

33

, 陈西敬

33

(中国药科大学药学院, 南京210009)

摘要通过查阅中、美、英、日四国药典中关于胰岛素标准的有关内容, 对比, 结果中国药典对胰岛素含量测定方法等与美、量测定的生物检定法改为HP LC 法, 。关键词:胰岛素; 中国药典; 美国药典; 英国药典; 日本药典; 中国分类号:R917

文献标识码:A

179304

the quality st andard of i n suli n i n

3

ChP with those i n BP, USP and JP

ZHANG Ge, DONG J ing, T ANG Yue, ZHU J ia -bi

33

, CHEN Xi -jing

33

(College of Phar macy, China Phar maceutical University, Nanjing 210009, China )

Abstract:T o investigate the li m it contents f or quality standard of insulin fr o m the main phar macopoeias being used in the world . l ooking int o the official monographs and appendices in the ChP, USP, BP and JP . The insulin assay method in the ChP is inferi or t o that of USP and BP and the revisi on see m s urgent . Key words:insulin; ChP; USP; BP; JP; quality standard

体内胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性

物质如葡萄糖等的激动而分泌的一种激素, 由51个氨基酸组成, 相对分子质量近6000, 在调节机体糖代谢、脂肪代谢和蛋白质代谢方面有重要作用, 是维持血糖在正常水平的重要激素之一。自1921年Banting 与Best 首次从牛胰腺中分离出胰岛素并于1922年应用于临床治疗以来, 胰岛素一直在糖尿病治疗中发挥着不可替代的作用。它的发现和应用被当作二十世纪生物科学发展的里程碑, 它也是第一个由DNA 重组技术生产的药品, 为DNA 重组技术

[1]

在医药、农业、化工等方面的应用开辟了新纪元。

胰岛素根据其来源不同, 可分为三类。1. 动物胰岛素:从猪和牛的胰腺中提取, 两者药效相同, 但与人胰岛素相比, 猪胰岛素中有1个氨基酸不同, 牛胰岛素中有3个氨基酸不同, 因而易产生抗体。2. 半合成人胰岛素:将猪胰岛素第30位丙氨酸, 置换成与人胰岛素相同的苏氨酸, 即为半合成人胰岛素。3. 生物合成人胰岛素:利用生物工程技术获得的高纯度的基因重组人胰岛素, 其氨基酸排列顺序及生

物活性与人体本身的胰岛素完全相同。

随着糖尿病人日益增多, 对胰岛素的需要也逐年增长, 有关胰岛素生产工艺及剂型的研究一直在深入进行着, 对胰岛素及其制剂的质量要求也在不断提高。药典作为各个国家药品生产、供应、使用和管理的法定技术依据。对保证药品质量和保障用药

[2]

安全具有十分重要的作用。随着胰岛素检测技术的逐步发展, 药典关于其质量标准的规定也在不断改善。现将中国药典(ChP2005年版) 、美国药典(USP31版) , 英国药典(BP2007版) 及日本药局方(JP15版) 中胰岛素质量标准的测定方法进行总结和比较, 分析其发展趋势, 并对中国药典与国外药典的差距和改进办法进行论述。

各国药典历年来对胰岛素质量标准的改进111中国药典对胰岛素质量标准的改进情况

中国药典从1953年版至2005年版均收录了有关胰岛素的质量标准。但在1953年版和1963年版中仅收载了胰岛素注射液的质量标准, 至1977年版1

[3～13]

才开始收载原料药质量标准, 其中关于胰岛素的鉴

3国家高技术研究发展计划(863) 资助项目(项目名称:基因重组人胰岛素吸入粉雾剂研制的关键技术与应用编号:2007AA02Z171) 33通讯作者　陈西敬:Tel:(025) 83271286; E -mail:chenxj@jl online . com 　朱家壁:Tel:(025) 85338217; E -mail:zjbbox02@vi p. 163. com

—1970—药物分析杂志Chin J Phar m Anal 2009, 29(11)

别主要通过酸碱法和小鼠惊厥法, 含量测定选用生物检定法。1995年版开始增加了电泳法和葡聚糖凝胶法对有关蛋白质和大分子蛋白质的测定。而各版对含量测定方法一直没有改变, 一直采用生物检

[14]

定法。各版药典的主要发展变化见表1。112美国药典对胰岛素质量标准的改进情况

美国药典过去对于有关蛋白质和大分子蛋白质的测定分别选用过电泳法和凝胶色谱法, 而到第24版时, 均改为HP LC 法。在21生物检定法, 至21版将HP LC , 24版, 只收录HP LC 法(31) 中, , 英国药典对胰岛素质量标准的改进情况

英国药典至1993版对有关蛋白质和大分子蛋白的测定仍分别选用电泳法和凝胶色谱法, 到1998版时均改为HP LC 法; 对胰岛素含量的测定, 在1988版之前均为生物检定法, 而到1993版改为HP LC 法。自2002版将牛、猪、人胰岛素质量标准113

测定, 且至今对大分子蛋白质、有关蛋白质、微生物

限度和细菌内毒素等均未作要求, 该药典自第14版开始收录重组人胰岛素。近三版日本药典(JP13, 14, 15) 中, 除第15版中将部分项目的质量单位改变(例:0101g 改为10mg ) 外, 对其它方面的内容均无修订。2中、美、比中、日四国现行药典(BP2007, JP15) , 我们发现各国药(表2) 。鉴别方面, 中国药典采用酸碱法、小鼠惊厥法和HP LC 3种方法进行鉴别, 日本药典中对胰岛素仅采用沉淀法进行鉴别, 而美、英药典均直接采用HP LC 法进行鉴别; 有关蛋白质(有关物质) 的测定方面, 中国药典采用电泳法, 而美国药典则已经采用HP LC 法, 显然, 方法准确度高于中国药典; 大分子蛋白质检测方面, 中国药典和英国药典选用分子排阻色谱法, 而美国药典则选取HP LC 法; 含量测定方面, 中国药典至今仍为生物检定法———小鼠血糖法; 日本药典采取双交叉兔血糖法, 而英、美药典则早已淘汰了生物检定法而选用HP LC 法; 其他方面, 与美国药典和英国药典相比, 中国药典尚缺少对胰岛素原及细菌内毒素检查的要求, 此外美国药典还对微生物限度检查有具体要求。

分叙, 至2005版又单列出人胰岛素类似物A s part 的质量标准, 近三版的药典(2004, 2005, 2007) 一直都有对语言方面的改进, 使其叙述更有条理, 而实际内容和条款变化不大。

114日本药典对胰岛素质量标准的改进情况

日本药典目前仍采用兔血糖法进行胰岛素含量

Tab 1

项目(ite m s )

表1　不同时期中国药典胰岛素质量标准比较

Co m par ison of the qua lity st andard of i n suli n i n d i fferen t ChP ed iti on s

1985年版(1985ed . )

1990年版(1990ed . )

1995年版(1995ed . ) (1) 、(2) 及(3) HP LC 法((1) , (2) &(3) HP LC )

2000年版(2000ed . )

2005年版(2005ed . )

1977年版(1977ed . )

(1) 酸碱法, (2) 小鼠惊厥法((1) che m ical, (2) ani m al

-(-) -(-) -(-) -(-) -(-) -(-)

鉴别(identificati on )

同1977年版(as 1977ed . )

-(-) -(-) -(-)

同1977年版(as 1977ed . )

276n m 吸收度为0. 48～0. 55

(abs orbance at 276n m )

-(-) -(-) 14. 5%-16. 0%(14. 5%-16. 0%)

同1995年版(as 1995ed . )

同1995年版(as 1995ed . )

吸收度(abs orbance )

同1990年版(as 1990ed . )

同1990年版(as 1990ed . )

同1990年版(as 1990ed . )

有关蛋白质(related p r oteins )

电泳法(electr ophoresis )

同1995年版(as 1995ed . )

同1995年版(as 1995ed . )

大分子蛋白质(high molecular weight p r oteins )

分子排阻色谱(size -exclusi on chr o mat ography )

同1995年版(as 1995ed . )

同1995年版(as 1995ed . )

氮含量(nitr ogen content )

-(-) -(-) -(-)

同1990年版(as 1990ed . )

同1990年版(as 1990ed . )

同1990年版(as 1990ed . )

干燥失重(l oss on drying )

≤10%(≤10%)

同1990年版(as 1990ed . )

-(-)

同1990年版(as 1990ed . )

-(-)

同1990年版(as 1990ed . )

-(-)

炽灼残渣(residue )

≤2. 0%(≤2. 0%)

含量测定(assay )

生物检定法≥25μ・mg -1(bi oassay ≥25μ・mg -1)

同1977年版(as 1977ed . )

生物检定法≥26μ・mg -1(bi oassay ≥26μ・mg -1)

同1990年版(as 1990ed . )

同1990年版(as 1990ed . )

同1990年版(as 1990ed . )

类别(category )

激素类药(a mcinonide )

同1977年版(as 1977ed . )

降血糖药(hy poglyce m ic )

同1990年版(as 1990ed . )

同1990年版(as 1990ed . )

同1990年版(as 1990ed . )

药物分析杂志Chin J Phar m Anal 2009, 29(11) 表2　中、美、英、日现行药典中胰岛素质量标准比较

Tab 2

鉴别(identificati on )

—1971—

Co m par ison of the qua lity st andard of i n suli n i n presen t ChP, USP, BP and JP

ChP

(1) 酸碱法(2) 小鼠惊厥法(3) HP LC 法((1) che m ical (2) ani m al (3) HP LC

USP HP LC (HP LC ) -(-) HP LC (HP LC )

HP LC ) ++((+-(-) +(+) +(+) +(+) HP LC (HP LC )

BP HP LC (HP LC ) +(+) HP LC (HP LC )

JP

沉淀法(p reci p itati on )

-(-) -(-) -(-) +(+) +(+) +(+) +(+) -(-) -(-) -(-)

吸收度(abs orbance ) 有关蛋白质(related p r oteins ) 大分子蛋白质(high molecular weight p r oteins )

+(+)

电泳法(electr ophoresis ) 分子排阻色谱(size -exclusi on chr omat ography )

+(+) -() ) +) -(-) -(-) -(-)

size o )

+() +(+) +(+) -(-) -(-) +(+) +(+) HP LC (HP LC )

干燥失重(l oss on drying ) 炽灼残渣(residue on igniti on ) 锌含量(zinc content ) 氮含量(nitr ogen ) 微生物限度(m li ) 细胞内毒素() 胰岛素原(p r oinsulin ) 含量测量(assay )

小鼠血糖法(mouse bl ood glucose assay )

兔血糖法

(rabbit bl ood glucose assay )

3　重组人胰岛素(表3) 。中国药典中的测定项目与现行的美国药典

从2000年第7版中国药典开始收录重组人胰

岛素的质量标准, 而到2005年版又进行了原则性的调整。如将大分子蛋白质的测定方法由HP LC 法改为分子排阻色谱法, 将无菌检查由薄膜过滤法改为微生物限度测定法。含量测定采用反相HP LC 法

Tab 3

鉴别(identificati on )

相似, 但与美国药典稍有不同的是:对人胰岛素有氮含量及炽灼残渣的检查要求。而日本药典和英、美两国药典相比, 缺少微生物限度项的要求。总体而言, 与动物胰岛素相比, 中国药典关于人胰岛素的质量标准与美英质量标准相差较小。

表3　中、美、英、日现行药典中人胰岛素质量标准比较

Co m par ison of the qua lity st andard of hu man i n suli n i n presen t ChP, USP, BP and JP

ChP HP LC (HP LC ) HP LC (HP LC )

USP HP LC (HP LC ) HP LC (HP LC ) HP LC (HP LC ) +(+) -(-) UV (UV ) -(-) +(+) +(+) HP LC (HP LC )

BP HP LC (HP LC ) HP LC (HP LC )

JP HP LC (HP LC ) HP LC (HP LC ) HP LC (HP LC ) +(+) -(+)

有关蛋白质(related p r oteins )

大分子蛋白质(high molecular weight p r oteins )

分子排阻色谱(size -exclusi on chr omat ography )

+(+) +(+) UV (UV ) +(+) +(+) +(+) HP LC (HP LC )

分子排阻色谱(size -exclusi on chr o mat ography )

+(+) +(+)

干燥失重(l oss on drying )

炽灼残渣(residue on igniti on )

锌含量(zinc content )

原子吸收光谱

(AAS ) -(-) -(-) +(+) HP LC (HP LC )

原子吸收光谱

(AAS ) -(-) -(-) +(+) HP LC (HP LC )

氮含量(nitr ogen content )

微生物限度(m icr obial li m its )

细胞内毒素(bacterial endot oxins )

含量测量(assay )

—1972—药物分析杂志Chin J Phar m Anal 2009, 29(11)

通过以上比较可以看出, 四国药典关于胰岛素质量标准存在较大的差异。就胰岛素的含量测定来说, 中国和日本药典目前仍在采用生物检定法。虽然生物检定法一般与药物的活性密切相关, 且结果较为直观, 但使用动物量较多, 操作烦琐, 影响因素多, 实验条件难以控制, 与HP LC 法相

[15]

比精密度差, 因此英美药典早已不选用这种方法。如美国药典在1985年第21版即将HP LC 法与生物检定法同时载入, 至2000年第24版则只收录HP LC 法。英国药典在1988与HP LC 法同时载入, 的2005, 质量标准远。

过去临床使用的胰岛素是从牛或猪胰腺中直接提取的, 由于当时工艺条件较为落后, 所以产品纯度较低, 难以用色谱法进行定量分析, 只能依赖生物检定法来检测其效价。近年来随着提纯工艺的改进, 使产品达到高纯度与单组分。另外, 随着物理化学分析仪器的逐渐发展, HP LC 法以其良好的精密度

[16]

和重现性, 得到越来越多的利用。如李湛君等对比了RP -HP LC 和生物检定法(小鼠血糖法) , 实验证明, 2种方法测定结果基本吻合, 无显著差异。HP LC 法较生物检定法更加的快捷, 可作自动连续分析, 而生物检定法与之相比准确性较差且费用昂[17][18, 19]贵。本文作者利用HP LC 法对胰岛素吸入粉雾剂的含量和有关物质进行测定, 证明了与生物法相比HP LC 法测定结果的精密度可大大提高, 且可节约时间和测试成本, 完全可以代替生物检定法进行胰岛素含量测定。除进行常规的效价测定外, HP LC 法可以快速、有效地对胰岛素注射液中的脱酰胺胰岛素、胰岛素原以及一些杂质进行检测, 为胰岛素制剂的质量控制和安全评价提供参考。而在进行生物检定法试验的过程中, 即使出现过敏或动物死亡等急性反应, 也会因整体动物的复杂性而无从得知产生的原因。

药典规定的标准, 应是在安全、有效前提下, 可以正常生产、使用药品的质量标准。所用的检测方法, 也应在考虑国家的经济状况、科技实力和相关人员素质等条件下具体选择。随着我国分析技术的进步和色谱分析仪器的普及, 目前我国已具备修订和完善胰岛素质量标准的条件。故作者建议我国药典

在今后的修订版中对胰岛素的含量测定应淘汰生物检定法而改选HP LC 法, 其它项目也应参考国外药典改用更加先进的方法。

参考文献

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(本文于2008年12月18日收到)