橡胶树种子的体外抗菌活性研究

　　【摘 要】目的：研究橡胶树种子对3种临床常见菌株的抗菌活性。方法：采用纸片扩散法测定橡胶树种子各部位浸膏的抑菌圈。结果：橡胶树种子乙酸乙酯部位和正丁醇部位对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产超光谱β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均>6 mm。结论：橡胶树种子有一定的抗菌活性，且其乙酸乙酯部位和正丁醇部位在浓度为50 mg/mL抗菌活性相当，石油醚部位则没有抗菌活性。 　　【关键词】橡胶树种子 抗菌活性 纸片扩散法 　　橡胶树Hevea brasiliensis （Willd.ex A.Juss.） Muell.Arg.为大戟科橡胶树属植物，原产巴西，现广泛栽培于亚洲热带地区，我国台湾、福建等地均有栽培，以海南和云南种植较多，本种是最主要的天然橡胶植物[1]。橡胶树具有很高的经济价值，是制备天然橡胶的材料，广泛用于工业、国防、医药卫生等领域。橡胶树种子也有很高的应用价值，种仁含油量高达45%～55%，主要成分有豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸等[2]。研究表明[3-5]，橡胶树种子能够降血脂，还能改善家兔主动脉动脉粥样硬化病变。然而对橡胶树的研究多集中在基因组学方面，药学方面的研究很少[6-7]。 　　本试验采用纸片扩散法对橡胶树种子的抗菌活性进行了初步研究，以期丰富橡胶树的研究开发。 　　1 仪器和材料 　　1.1 仪器 　　JJ-CJ-2FD超洁净工作台（吴江市净化设备总厂）；GRP-9720恒温隔水式培养箱（上海森信试验仪器有限公司）；ZWY-211C恒温卧式培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；LDZX-30KB立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；ZWX-201A紫外线空气消毒器（广东粤华医疗器械厂）；涡旋器；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。 　　1.2 试剂 　　营养肉汤，营养琼脂（北京奥博星生物技术有限公司）；青霉素G（Penicillin G.K-salt：C16H17N2O4SK），activity：156U/mg，25mg；硫酸链霉素（Streptomycin suifate research grade： C21H39N7O12 1.5H2SO4），activity：759U/mg，10mg（购买于SERVA公司）；DMSO，1，3-丙二醇，无水乙醇（均为分析纯）。 　　1.3 供试菌株 　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），产超光谱β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌（Extended spectrum β-lactamases Staphylococcus aureus，ESBLs-SA），所有菌株均为河南大学淮河医院临床分离菌株，经全自动微生物分析仪VITEK-AMS鉴定，符合率≥99%。 　　1.4 药材 　　橡胶树种子于2014年11月采集于海南省万宁市兴隆镇，由河南大学中药研究所李昌勤教授鉴定为大戟科橡胶树（H. brasiliensis）的种子。标本现存于河南大学中药研究所。 　　2 方法 　　2.1 液体和固体培养基的配置 　　营养肉汤培养基配制：称取营养肉汤干粉18g，用1000mL蒸馏水溶解，分装于锥形瓶中，于121℃，0.15MPa下灭菌15min，备用。 　　营养琼脂培养基配制：分别称取琼脂干粉15 g和营养肉汤干粉18g，用1000mL蒸馏水加热溶解，分装于锥形瓶中，于121℃，0.15 MPa下灭菌15min后，立刻将灭菌琼脂分装于无菌平皿中，备用。 　　2.2 菌悬液的制备 　　将临床分离鉴定后的SA、MRSA、ESBLs-SA进行菌株扩大培养，平板划线法接种在琼脂平皿中，37℃培养18 h，用接种环取出单个菌落2个，接种在100 mL灭菌肉汤中，于120 r/min、37℃恒温摇床培养至对数生长期，酶标仪测定吸光度值，用新鲜灭菌的肉汤将菌液稀释至吸光度值为0.1，稀释后菌液约为1×108 CFU/mL，现配现用。 　　2.3 样品的制备 　　取橡胶树种子650g，用70%乙醇浸渍提取3次，每次3天，合并提取液，浓缩得到浸膏（68g），将浸膏用水分散，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩，分别得到石油醚部位（8g）、乙酸乙酯部位（18g）、正丁醇部位（10g）。分别称取适量各部位浸膏加适量DMSO溶解，配成50mg/mL溶液，备用。 　　2.4 抑菌圈的测定 　　采用纸片扩散法测定橡胶树种子的抗菌活性。按照文献[8]的方法，用微量加样器吸取5μL样品加到直径为6mm滤纸片上，挥干溶剂后，等距贴于含菌平板上，用溶剂做空白对照，用硫酸链霉素和青霉素G做阳性对照（浓度为4 mg/mL），于37℃恒温培养箱内培养18h，记录抑菌圈直径。每份样品均平行操作3次，结果取平均值。所有操作均在无菌条件下进行。 　　3 结果 　　本文章采用纸片扩散法考察了橡胶树种子石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位对三种金黄色葡萄球菌的抗菌活性，结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法（One-Way ANOVA）比较其显著性差异，具体结果见表1。 　　4 讨论 　　由表1可以看出，橡胶树种子乙酸乙酯部位和正丁醇部位在浓度为50 mg/mL对SA、MRSA、ESBLs-SA均有一定的抑制活性，与阳性对照青霉素G和硫酸链霉素相比，二者抗菌活性均弱于阳性对照，结果具有显著性差异（*P≤0.5，***P≤0.001）。橡胶树种子石油醚部位则没有显示抗菌活性，说明橡胶树种子的抗菌活性部位为乙酸乙酯部位和正丁醇部位。 　　橡胶树的应用价值众所周知，早在90年代，就有人预测橡胶树可能成为未来的药物工厂，能用于生产胰岛素疫苗，抗血栓药物等[9]。目前橡胶树的研究主要集中在基因组学、蛋白质组学等生物信息学的研究，取得了很大成就[10-12]。本文从药学的角度对橡胶树种子进行研究，丰富了橡胶树的研究内容。 　　参考文献： 　　[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1982，31：202. 　　[2]尹桂豪，曹建华，刘春华，李春丽，张世瑞.橡胶树种子油的超临界提取及成分分析[J].安徽农业科学，2009，19：8814-8815. 　　[3]刘超然，王明英，杨良，等.橡胶种子油医用的研究[J].热带作物学报，1980，1（1）：89-97. 　　[4]李运珊，刘玉仙，李世泰.精炼橡胶种子油降血脂的临床应用研究[J].海南医学院学报，2006；6（2）：65-68. 　　[5]唐朝才，刘爱华，杨树，等.橡胶种子油食用价值的研究[J].热带作物学报，1981，2（1）：91-100. 　　[6]王靖，邓小敏，田维敏.巴西橡胶树乳管细胞HblMYC3互作蛋白筛选与功能分析[J].热带作物学报，2016，06：1-7. 　　[7]何海霞，张宇，王萌，杨叶，郑服丛.巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）HbMlo7基因克隆与表达分析[J].植物生理学报，2016，06：917-925. 　　[8]康文艺，刘瑜新，宋艳丽，张丽.尼泊尔酸模α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗菌活性研究[J].中成药，2010，07：1249-1251. 　　[9]吴贵洲. 橡胶树――未来的药物工厂[J].热带作物译丛，1992，06：21. 　　[10]邓玉杰，余海洋，张宇，王萌.一个巴西橡胶树过氧化物酶基因克隆与生物信息学分析[J].热带农业工程，2014，04：1-8. 　　[11]朱晋恒，戚继艳，肖小虎，唐朝荣.巴西橡胶树葡萄糖/核糖醇脱氢酶基因的克隆和表达分析[J].热带作物学报，2016，06：1-9. 　　[12]康桂娟，黎瑜，曾日中.巴西橡胶树HbNAM基因克隆和表达分析[J].南京林业大学学报（自然科学版），2016，01：59-64.