细胞生物学实验报告5
湖南科技学院实验报告
学生姓名 李诗 学号 [1**********]5 专 业 生物技术 年级、班级 1102
课程名称 细胞生物学实验 实验指导老师 蒋琼凤、沈玉平
细胞中过氧化物酶的显示
细胞凋亡的形态学检测与观察
一、实验目的：
1. 掌握显示细胞中过氧化物酶反应的原理和方法。
2. 了解细胞凋亡的生物学意义
3. 掌握凋亡细胞的形态学检测方法
二、实验原理：
1. 细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。中间产物蓝色联苯胺是不稳定的，无需酶的参加即可氧化为棕色化合物。
2．细胞凋亡是指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶 参与的过程。
3. 凋亡细胞形态学特征是:体积变小, 细胞质浓缩; 细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化); 细胞膜有小泡状形成; 晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体; 根据细胞凋亡形态学特征进行显微观察是检测细胞凋亡的一种直观、可靠的方法。
三、实验步骤：
细胞中过氧化物酶的显示
1、在载片上滴一滴PBS 缓冲液；
2、取骨髓细胞：用断颈法处死小鼠，立即剪取后肢，去除肌肉，剥出后肢股骨，剪开股骨一端，用牙签尖的一端插入剪开的小孔中，抠取少许骨髓细胞置滴有PBS 的载片上；
3、涂片：用另一玻片将骨髓细胞沿一个方向涂布推开，室温晾干；
4、媒染：在涂片上滴0.5％硫酸铜液，以盖满涂片为宜，处理30秒-1分钟。
5、倾去硫酸铜液，直接滴入联苯胺混合液反应6分钟（以盖满涂片为宜）
6、清水冲洗，番红复染2min 。
7、镜检：清水冲洗，室温晾干，先低倍镜下观察，后换高倍镜下观察（油镜100×）
细胞凋亡的形态学检测与观察
吉姆萨染色:
1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)
2、生理盐水轻轻漂洗细胞
3、95%乙醇固定5min
4、PBS 缓冲液洗2次
5、吉姆萨染色液染色5min
6、蒸馏水轻轻洗去染液
7、普通光学显微镜下观察。
吖啶橙染色:
1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)
2、生理盐水轻轻漂洗细胞
3、甲醇：冰醋酸（3：1）固定5min
4、PBS 缓冲液洗2次每次1min
5、 0.01%吖啶橙染色液在避光环境下染色5min
6、蒸馏水轻轻洗去染液
6、选用蓝光激发滤片在荧光显微镜下观察。
四、结果与分析：
1、根据随机选择的几个视野的统计，该样品的细胞凋亡率=227/506×100﹪=44.9﹪
Hela 细胞凋亡过程中核染色质
的形态变化（吖啶橙染色）
五、思考题：
1、细胞凋亡的调控机制
细胞凋亡是一个受基因调控、众多细胞膜受体和胞浆蛋白参与的细胞主动自杀过程，其触发因素多种多样，包括细胞内诱导因子和抑制因子对细胞凋亡的调控。
2、细胞凋亡的特征
凋亡细胞形态学特征是:体积变小, 细胞质浓缩; 细胞核发生染色质凝 聚和聚集于核膜周围(边缘化); 细胞膜有小泡状形成; 晚期细胞膜内陷形 成大小不同的凋亡小体。
3、研究细胞凋亡的方法
定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）
定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。