RP-HPLC法测定糖尿病患者红细胞膜磷脂酰胆碱含量

　　【摘要】 目的 采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定糖尿病患者红细胞膜磷脂酰胆碱含量。方法 色谱分析条件:Shim - pack VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm) ,以乙腈�∶�甲醇�∶�85%磷酸(100�∶�10�∶�1.8)为流动相,等速洗脱,流速1 ml/min,检测波长203 nm,柱温30℃。结果 磷脂酰胆碱线性范围为0.1～1.0 mg/ml(相关系数r=0.9985),平均回收率97.2%,糖尿病并发症患者红细胞膜磷脂酰胆碱含量较正常人明显降低。结论 本方法重现性好,适用于测定红细胞膜磷脂酰胆碱的含量。 　　【关键词】糖尿病;红细胞膜;反相高效液相色谱法;磷脂酰胆碱 　　 　　红细胞膜磷脂成分的改变与糖尿病微血管病变有着密切的关系[1-4]。因此,对糖尿病患者红细胞膜磷脂组成成分的分析显得尤为重要。高效液相色谱法(HPLC)测定磷脂成分操作简便、省时,而且定量准确,具有方便、快速、高灵敏度、无损伤的特点[5]。本文首次采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定了糖尿病患者红细胞膜磷脂酰胆碱的含量,为进一步研究糖尿病患者红细胞膜磷脂组成奠定基础。 　　1 研究对象、实验仪器与材料 　　1.1 研究对象正常对照组:健康志愿者40例(男18例,女22例),空腹血糖(FBG)20 μg/min,并排除由心脏、肝脏、肾脏及其他全身疾病或应用影响肾功能药物引起蛋白尿者。病程>10年。 　　1.2 实验仪器与材料 CBM220A高效液相色谱仪(日本岛津公司),SPD220A检测器,二元梯度泵, LC-Solution色谱工作站,Milli-Q A10型纯水仪(M ILL IPORE),超速冷冻离心机,台式低速离心机。磷脂酰胆碱标准品(PC)购自sigma公司,甲醇、乙腈均为色谱纯,氯仿、磷酸为优级纯。 　　2 方法与结果 　　2.1 色谱分析条件岛津VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);乙腈∶甲醇∶85%磷酸(100�∶�10�∶�1.8)为流动相;等度洗脱;流速1 ml/min;检测波长203 nm;柱温30℃;进样量10 μl。 　　2.2 样品溶液制备。 　　2.2.1 红细胞膜的制备 晨间空腹肘静脉采血3 ml,肝素抗凝,采用Dodge改进的方法[6]分离制备红细胞膜。 　　2.2.2 红细胞膜脂质的提取以及样品溶液的制备 取上述制备的红细胞膜1 ml,Higgins法[7]进行膜脂质的提取,重复3次,将吸取的含脂氯仿液精确定容至5 ml,氮气吹干,封口膜封口后置-20℃冰箱保存,色谱分析时用氯仿溶解,过0.45 μm有机系微孔滤膜。 　　2.3 标准溶液绘制 精密称取20 000 mg的磷脂酰胆碱标准品,氯仿溶解置于10.0 ml容量瓶中,流动相定容,制成2.0 mg/ml的磷脂酰胆碱标准贮备溶液。 　　2.4 标准曲线绘制 分别精密量取2.0 mg/ml的磷脂酰胆碱标准品贮备溶液0.5,1.0, 2.0,4.0,5.0 ml置于10 ml容量瓶中,流动相定容,制成0.1, 0.2, 0.4, 0.8和1.00 mg/ml的磷脂酰胆碱标准溶液。色谱分析时,对照品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜。各吸取10 μl进样,按2.1所述色谱条件进行色谱分析。以峰面积为纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线并进行回归计算,回归方程Y=4.3X+0.204, r=0.998 7。表明磷脂酰胆碱在0.1～1.0 mg/ml范围内线性良好。 　　2.5 精密度实验 取按2.2所述方法制备的正常人对照组样品溶液,连续进样5次,按2.1所述色谱条件进行色谱分析,记录色谱图。磷脂酰胆碱峰面积RSD为2.83%,表明仪器精密度良好。 　　2.6 重现性实验 分别按2.2所述方法制备同一正常人样品溶液5份,按2.1所述色谱条件进行色谱分析,记录色谱图。磷脂酰胆碱峰面积RSD为2.90%,表明方法重现性良好。 　　2.7 回收率实验 精密称取已知含量的样品,定量加入磷脂酰胆碱标准品,按2.1所述色谱条件进行色谱分析,测定平均回收率为97.2%(n=5),磷脂酰胆碱峰面积RSD为3.02%。 　　2.8 红细胞膜磷脂酰胆碱含量的测定 正常人组、糖尿病无并发症组与糖尿病并发症组抗凝血分别按2.2所述方法制备样品溶液,2.1色谱分析条件进行色谱分析,色谱图见图1。根据标准曲线回归方程计算各组标本红细胞膜磷脂酰胆碱含量,结果见表1,红细胞膜磷脂酰胆碱色谱图见图1。 　　 　　图1 红细胞膜磷脂酰胆碱色谱图 　　2.9 统计学方法 应用SPSS 10.0软件对检测数据进行统计学分析。检测数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较用u检验。 　　3 结果与讨论 　　3.1 磷脂酰胆碱的定性分析 采用与标准品对照保留时间的方法,确定了正常人组及糖尿病无并发症组以及糖尿病并发症组红细胞膜上的磷脂酰胆碱(PC)。 　　3.2 磷脂酰胆碱的定量分析 根据对照品回归方程计算磷脂酰胆碱含量,结果见表1。 　　 　　表1 　　 　　正常人和NIDDM患者红细胞膜磷脂酰胆碱含量比较(x±s) 　　 　　 　　 　　分组性别 年龄 磷脂酰胆碱PC(mg/ml)P值 　　正常组男18 　　(N=40)女2250±100.494±0.037 　　DM无并发症组男21 　　(N=45)女2450±100.453±0.017　　DM并发症组男9 　　(N=25)女1660±100.385±0.018　　 　　 　　可以看出,糖尿病无并发症组红细胞膜磷脂酰胆碱(PC)的含量低于正常对照组(P　　3.3 目前,临床对红细胞膜磷脂成分的分析多采用薄层层析法,分光光度法等方法,这些方法虽适合于常规实验室,但操作复杂,重复性差,样品易丢失,且不可以同时测定较多数量的样品。本文首次采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定了糖尿病患者红细胞膜磷脂酰胆碱的含量,该方法在5 min内即可完成红细胞膜上磷脂酰胆碱(PC)的分离,操作简便、基线平稳、分离效果良好、定量准确、重现性好、干扰小,适用于测定红细胞膜磷脂酰胆碱的含量。 　　糖尿病(DM)是全球最常见的内分泌代谢病之一,据世界卫生组织糖尿病有关专家统计,75.67%的患者死于慢性并发症,糖尿病慢性并发症是日前患者致死、致残的重要原因[2,8]。糖尿病患者糖代谢紊乱的同时伴有脂代谢紊乱,使糖尿病患者红细胞膜磷脂成分发生变化,最终导致红细胞变形能力下降,聚积能力增强,血粘度增加。对于成熟红细胞的结构与功能,膜脂质的更新是极为重要的[4,9]。红细胞膜上的磷脂酰胆碱主要分布于膜外层,60%~70%磷脂酰胆碱(PC)直接与血浆中的同系物进行自由交换,与正常人相比较糖尿病无并发症患者的红细胞膜磷脂酰胆碱降低,糖尿病并发症患者的红细胞膜磷脂酰胆碱显著降低,可以看出糖尿病患者代谢紊乱对红细胞膜磷脂酰胆碱代谢的影响更为直接。因此,对红细胞膜上磷脂酰胆碱的监测能够为预防糖尿病并发症的发生和治疗监测提供一定的辅助诊断依据。

　　 参 考 文 献 　　[1] 杨金奎.糖尿病并发症发病机制新认识.国际内分泌代谢杂志,2008,28(1):18-21. 　　[2] WHO Multinational Study Group.The WHO multinational study of vascular disease in diabetes.Diabetes Res Clin Pract,2002,56:S6. 　　[3] 邓华聪,邱鸿鑫,汪恕萍,等,糖尿病患者红细胞膜磷脂成分改变与脂质过氧化视网膜病变的关系.中华内科杂志,1994,33(12):833-834. 　　[4] MellitusSetter et al.Biochemical Pathways for Microvascular Complications of Diabetes Ann Pharmacother,2003,37:1858-1866. 　　[5] 崔莹.磷脂的高效液相色谱分析.福建分析测试,2007,16(1):71-74. 　　[6] Caimi G, P resti L P,Montana M , et al.Platelet membrane fluidity, platelet membrane lipid pattern and platelet cyto solic Ca2+ content in subuects with vascular atheo sclerotic disease.Clin Hemorheol,1994,14 (3):393. 　　[7] Higgins JA.Seperation and analysis of membrane lipid components.In:Findlay JBC, ed.Biological membrane a partical approach.Oxford:IRL press,1987:103-106. 　　[8] 李红.糖尿病微血管病变发病机制和治疗靶点.浙江大学学报,2006,35(3):233-237. 　　[9] Jenkins, A.J.1; Rowley, K.G.1,et al.Poproteins and Diabetic Microvascular Complications.J Current Pharmaceutical Design, 2004,10(27):3395-3418.