拟南芥原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法整理
一、土培室播种种植的拟南芥。
二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。
四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml 酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。）
六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液）
七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。
九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g ，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。
十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行
十二、100g 离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG 溶液（1m ）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb 的质粒DNA ）至2ml 离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。
十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。
十八、室温下用台式离心机100g 离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g 离心两分钟去上清。
十九、用1ml WI溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中。
二十、室温下（20-25℃）诱导原生质体18小时以上。 二十一、激光共聚焦显微镜下观察GFP 标签表达。
溶液配制
1、纤维素酶解液：
2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量） 3、W5 溶液
4、MMG 溶液
5、WI 溶液