镉超富集植物东南景天根系分泌物的代谢组学研究

第43卷

2015年1月摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇分析化学(FENXIHUAXUE)摇研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第1期7~12

DOI:10.11895/j.issn.0253鄄3820.140388

镉超富集植物东南景天根系分泌物的代谢组学研究

(东北大学资源与土木工程学院,沈阳110004)1

2罗庆1,2摇孙丽娜*2摇胡筱敏1(沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室,沈阳110044)

摘摇要摇利用基于气相色谱鄄质谱联用技术(GC鄄MS)的代谢组学方法,寻找不同处理条件间差异显著的镉超40滋mol/L镉分别处理4和8天后的东南景天根系分泌物样品,通过样品冻干、甲醇溶解、甲氧胺盐酸盐和N鄄甲基鄄N鄄(三甲基硅烷)三氟乙酰胺衍生化处理、GC鄄MS检测的分析过程,得到根系分泌物的表达谱。主成分分析和正交偏最小二乘判别分析(OPLS鄄DA)得分图可将不同处理条件间东南景天的根系分泌物质明显区分,运用OPLS鄄DA载荷图、模型的变量重要性因子和方差分析发现12个根系分泌物质在4组间存在显著性差异。它们的相对含量在不同处理条件间的变化趋势明显不同,表明东南景天可通过调节它们的分泌来耐受或超富集重金属镉。

关键词摇超富集植物;东南景天;根系分泌物;代谢组学;气相色谱质谱联用富集植物东南景天根系分泌物质,并探讨它们对东南景天耐受或超富集镉的可能作用机制。收集0和

1摇引摇言

断、药物研发、毒理学及药物作用机制研究等领域[2~8]。目前,代谢组学检测技术包括核磁共振技术和灵敏度高,而且有许多数据检索库,有助于代谢物的定性分析。

根系分泌物是植物为了增加营养物质的摄取或适应外界环境的胁迫而通过根系向周围环境分泌的小分子有机酸、氨基酸、脂肪酸、糖等物质,它可通过改变根际土壤的pH值与氧化还原电位(Eh)值、与重金属发生螯合或络合沉淀等化学反应、影响土壤微生物的数量和活性等,直接或间接地影响重金属在土壤中的结合形态及生物有效性[9]。目前,对超富集植物根系分泌物的研究主要集中在柠檬酸和草酸等小分子有机酸、总有机物或总有机碳上[10~13],而对超富集植物根系分泌物的组成成分分析及其在不同处理条件下的变化趋势的研究较少。

本研究应用基于GC鄄MS技术的代谢组学分析方法,分析镉超富集植物东南景天在不同镉处理条件下其根系分泌物的变化特征,寻找其可能的差异显著的根系分泌物质,通过这些物质的变化趋势来探索镉超富集植物东南景天耐受或超富集镉的可能作用机制。代谢组学是研究生物体受刺激或扰动而引起的体内代谢物动态变化的科学[1],广泛应用于疾病诊质谱技术,其中气相色谱鄄质谱联用技术(GC鄄MS)在代谢组学研究中有着非常重要的应用,其方法成熟,

2摇实验部分

2.1摇仪器与试剂TRACEGCUltra鄄PolarisQ气相色谱鄄质谱联用仪(配AI/AS3000自动进样器及Xcalibur1.4工作站,

甲醇(色谱纯,Fisher公司);吡啶(色谱纯,国药集团);N鄄甲基鄄N鄄(三甲基硅烷)三氟乙酰胺美国ThermoFisher公司);MG鄄2200氮气吹扫仪、FDU鄄1100真空冷冻干燥系统(TokyoRikakikai公司)。(N鄄Methyl鄄N鄄trimethylsilyltrifluoracetamide,MSTFA)、甲氧胺盐酸盐(Sigma公司);营养液组成物质及CdCl2(国药集团);实验用水为Milli鄄Q去离子水。

摇2014鄄05鄄04收稿;2014鄄07鄄07接受本文系国家自然科学基金(Nos.21037002,41071304,21107075)、辽宁省创新团队项目(No.LT2011017)资助*E鄄mail:[email protected]

2.2摇植物材料和培养方法

以浙江省衢州市古银矿生态型超富集型东南景天为供试植物。选择生长良好、粗细基本一致的植4天),然后转移至营养液培养(营养液组成参见文献[14])。培养期间,每4天更换1次营养液,用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl将营养液调至pH5.5,同时保持24h通气。连续培养16天,待长出4和8d后的根系分泌物。旺盛根系后,开始进行Cd处理,设2个Cd水平0和40滋mol/L,每个水平重复11次。分别收集处理

2.3摇根系分泌物的收集和测定

将东南景天从营养液中取出,去离子水冲洗根系3~5次后放入盛有50mL去离子水的玻璃管(用黑色胶布包住遮光)中,连续收集6h根系分泌液。根系分泌物的预处理、衍生化和GC鄄MS分析主要参考文献[15,16]的方法。将收集的根系分泌液于真空冷冻干燥机上冻干,用预冷的10mL甲醇将其转移至试管中,氮气吹干,然后加入40滋L20g/L甲氧胺盐酸盐吡啶溶液,37益反应2h,并伴随振荡,最后加入70滋LMSTFA,37益反应30min并伴随振荡。反应完成后,0.45滋m滤膜过滤至GC进样小瓶,待GC鄄MS分析。GC分析条件:色谱柱ThermoTR5鄄MS毛细管柱(30m伊0.32mm伊0.25滋m);色谱柱升温程序:初始物材料,截取含顶芽的5cm长带叶枝条,用300mL黑色塑料瓶培养。先用去离子水进行预培养(约230益;载气、辅助气:均为氦气,纯度为99.999%,载气流速为1mL/min(恒流);进样方式:不分流进样,不分流时间为0.75min,分流比为50颐1;进样量:1滋L。

全扫描,扫描范围为m/z50~600;溶剂延迟时间:3min。温度70益,保持1min,以1益/min升至76益,再以5益/min升至330益,并保持10min;进样口温度:MS分析条件:EI离子源,电离电压70eV;离子源温度:250益;传输线温度:250益;质谱扫描方式:

GC鄄MS数据采用AMDIS自动解卷积,并与植物代谢产物数据库Fiehn和GMD比对,对相似度大于2.4摇数据分析

70%的化合物予以认定,然后利用MET鄄IDEA对AMDIS输出结果进行提取和处理,接着将已鉴定的根系分泌物质的峰面积进行标准化(不同处理间同一保留时间化合物的峰面积之比),然后导入统计软件SIMCA鄄P13.0进行主成分分析(Principalcomponentanalysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonaltopartialleastsquaresdiscriminantanalysis,OPLS鄄DA),通过载荷图、模型的变量重要性因子(Variableimportancefactor,VIP)和方差分析(Analysisofvariance,ANOVA)寻找超富集植物东南景天在不同镉处理条件下差异显著的根系分泌物。

3摇结果与分析

3.1摇GC鄄MS分析结果0和40滋mol/L镉处理4天和8天后,超富集植物东南景天根系分泌物的GC鄄MS总离子流色谱图(TIC)见图1。通过对GC鄄MS数据分析,共鉴定出其中58种化合物,包括乳酸、草酸、琥珀酸等一系列核糖醇、松醇、胆固醇等醇类,及磷酸、月桂酸、十八烯酸等小分子代谢物。

取同一样品连续进样7次,计算各色谱峰相对峰面积的相对标准偏差。结果表明,各色谱峰的相对

3.2摇不同镉处理条件下东南景天根系分泌物的模式识别分析

将已鉴定的58种根系分泌物质通过无监督的主成分分析(PCA)和有监督的正交偏最小二乘判别分析(OPLS鄄DA),进行不同镉处理4天和8天间东南景天根系分泌物的模式识别,结果见图2。

通过对已鉴定的58种根系分泌物质的PCA分析发现(图2A),同一镉处理浓度下,不同镉处理时间东南景天根系分泌物样品能显著区分;而相同镉处理时间,不同镉处理浓度,东南景天根系分泌物样品也能区分,除了0与40滋mol/L镉处理8天后的样品有部分重叠。

通过进一步的OPLS鄄DA分析发现(图2B),相同处理条件下东南景天根系分泌物样品能明显的聚标准偏差(RSD)低于10%。小分子有机酸,缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸等一系列氨基酸,木糖、果糖、葡萄糖等糖类,十二烷醇、

摇图1摇超富集植物东南景天根系分泌物的GC鄄MSTIC色谱图Fig.1摇GC鄄MSTICchromatogramsofrootexudatesofthehyperaccumulatorS.alfredii

D.40滋mol/LCdtreatmentfor8days.A.0滋mol/L镉处理4天;B.40滋mol/L镉处理4天;C.0滋mol/L镉处理8天;D.40滋mol/L镉处理8天。A.0滋mol/LCdtreatmentfor4days;B.40滋mol/LCdtreatmentfor4days;C.0滋mol/LCdtreatmentfor8days;

部分已鉴定的根系分泌物质:1.丙三醇(Glycerol鄄3TMS);2.苏糖酸(Threonicacid鄄4TMS);3.核糖醇(Ribitol鄄5TMS);

4.十四烷酸(Tetradecanoicacid鄄1TMS);5.十六烯酸(9鄄Hexadecenoicacid鄄1TMS);6.十六烷酸(Hexadecanoicacid鄄1TMS);7.十八烯酸(Oleicacid鄄1TMS);8.十八烷酸(Octadecanoicacid鄄1TMS);9.二十二烷(n鄄Docosane);10.单十六醛丙三醇(1鄄Monohexadecanoylglycerol鄄2TMS);11.海藻糖(Trehalose鄄8TMS);12.胆固醇

(Cholesterol鄄1TMS)。

图2摇不同镉处理4天和8天后东南景天根系分泌物的PCA和OPLS鄄DA得分图

DA)scoresplotsofrootexudatesofthehyperaccumulatorS.alfredii

处理8天;B.OPLS鄄DA得分图。Fig.2摇Principalcomponentanalysis(PCA)andorthogonalpartialleast鄄squaresdiscriminationanalysis(OPLS鄄A.PCA得分图,(荫)0滋mol/LCd处理4天,(银)40滋mol/LCd处理4天,(姻)0滋mol/LCd处理8天,(▼)40滋mol/LCd

A.PCAscoresplots,(荫)0滋mol/LCdtreatmentfor4days,(银)40滋mol/LCdtreatmentfor4days,(姻)0滋mol/LCdtreatmentfor8days,(▼)40滋mol/LCdtreatmentfor8days;B.OPLS鄄DAscoresplots.

集在一起,而不同处理条件间东南景天根系分泌物样品能显著区分。

同。这一结果符合先前研究,土壤结构、植物种类、植物生长时期、营养水平和环境压力等因素能影响植物根系分泌物的组成成分和含量[17,18]。为了进一步找到对上述区分做出主要贡献的差异根系分泌物质,即可能导致镉超富集植物东南景天能耐受或超富集镉的优势根系分泌物质,本研究通过OPLS鄄DA分析的载荷图(图3,图中每一个X点代表一个根系分泌物质变量,离原点距离较远的点可能为差异显著根系分泌物质)、VIP值(VIP>1的物质可能为差异显著的根系分泌物质)和ANOVA,最终确定其中12种根系分泌物质的含量在不同镉处理

3.3摇镉超富集植物东南景天耐受或超富集镉的作用机制分析

表1给出了差异显著的东南景天根系分泌物质在不同处理条件下的相对含量,这些相对含量的变化可能是东南景天响应镉胁迫或植物生长时期的结果,可能与东南景天耐受或超富集镉的作用机制有关。条件间存在显著性差异(p

摇图3摇不同镉处理4天和8天后东南景天根系分泌物的OPLS鄄DA载荷图Fig.3摇analysis(OPLS鄄DA)loadingplotsofrootexudatesofthehyperaccumulatorS.alfrediiOrthogonalpartialleast鄄squaresdiscrimination(荫)X,根系分泌物质变量(therootexudatevariable);(银)Y,分组变量(thegroupvariable)。

表1摇不同处理条件间差异显著的东南景天根系分泌物质1摇PotentialbiomarkersinrootexudatesofthehyperaccumulatorS.alfredii

化合物Compounds

癸酸Decanoicacid

苯甲酸Benzoicacid

月桂酸Dodecanoicacid

壬酸Nonanoicacid

果糖Fructose

赤藓糖醇Erythritol

羟基乙酸2鄄Hydroxyaceticacid甘露醇Mannitol

核糖醇Ribitol

磷酸Phosphoricacid

甘油Glycerol海藻糖Trehalose0滋mol/L镉处理4天0滋mol/LCdtreatmentfor4days(n=11)0.00依0.000.00依0.001.00依0.091.00依0.091.00依0.171.00依0.141.00依0.131.00依0.181.00依0.151.00依0.141.00依0.131.00依0.2840滋mol/L镉处理4天40滋mol/LCdtreatmentfor4days(n=11)1.00依0.141.00依0.062.13依0.261.10依0.090.00依0.000.00依0.000.82依0.100.06依0.030.07依0.020.09依0.020.84依0.220.33依0.060滋mol/L镉处理8天0滋mol/LCdtreatmentfor8days(n=11)0.61依0.040.00依0.002.13依0.200.41依0.051.68依0.430.27依0.050.25依0.030.08依0.020.20依0.040.00依0.007.78依1.510.00依0.0040滋mol/L镉处理8天40滋mol/LCdtreatmentfor8days(n=11)0.00依0.000.31依0.020.67依0.120.19依0.030.33依0.060.00依0.000.13依0.010.00依0.000.07依0.020.00依0.007.95依1.960.00依0.00

注:数值为不同处理间同一保留时间化合物的峰面积的比值,平均值依标准偏差。Thevalueistheratioofthepeakareasofthecompoundswhichhavethesameretentiontimeamongthedifferenttreatments,mean依standarddevi鄄ation.摇摇癸酸和月桂酸在加镉处理4天时的分泌量较无镉处理有显著增加,8天时的分泌量较无镉处理有明显减少,表明在镉处理初期,东南景天可能通过根系分泌更多的癸酸和月桂酸来活化镉,以促进的镉的吸收;随着处理时间的增加,东南景天可能通过减少癸酸和月桂酸的分泌,进而减少镉的活化来耐受镉。

4天时有显著减少,表明镉处理能促进东南景天根系分泌出更多的苯甲酸,苯甲酸可能有助于东南景天对镉的超富集。

壬酸在加镉处理和无镉处理中均有分泌,但在4天时镉能促进东南景天根系壬酸的分泌,8天时却抑制了其分泌,可能是由于壬酸能够活化重金属镉。在镉处理初期,东南景天为了吸收更多的镉而增加壬酸的分泌,随着处理时间的延长,东南景天通过减少壬酸的分泌来减少土壤中的有效性镉,以保护东南景天不受镉的毒害。

果糖、赤藓糖醇、羟基乙酸、甘露醇和海藻糖的分泌量在加镉处理后均较无镉处理减少,可能是东南景天通过减少这些物质的分泌来响应镉胁迫。

核糖醇和甘油在加镉处理和无镉处理4天时均有分泌,加镉处理的分泌量明显小于无镉处理,但加镉处理和无镉处理8天时均未分泌核糖醇和甘油,可能是东南景天通过减少这两种物质的分泌来响应镉胁迫和植物生长时期。

磷酸在镉处理和对照中均有分泌,在相同处理时间不同镉处理浓度下分泌量变化差异不明显,但在相同镉处理浓度不同处理时间下分泌量变化差异较明显,表明磷酸的分泌与植物生长时期有关,与镉处苯甲酸在加镉处理4天和8天时的分泌量较无镉处理都有明显增加,但镉处理8天的分泌量较

理条件影响不大。

本研究利用基于GC鄄MS的代谢组学方法研究了镉超富集植物东南景天在镉胁迫下根系分泌物代谢谱变化。多元统计分析表明,不同处理条件间根系分泌物样品获得了很好的区分,并找出了12种在各处理间差异显著的根系分泌物质:癸酸、苯甲酸、月桂酸、壬酸、果糖、赤藓糖醇、羟基乙酸、甘露醇、海藻糖、核糖醇、磷酸和甘油,这些差异显著的根系分泌物质的变化趋势反映了超富集植物东南景天通过改变根系分泌物质的组成或含量来耐受或超富集重金属镉的可能的作用机制。

References1摇HongM,JinY,MaiYQ.Comp.Biochem.Physiol.B,1992,101(12):35-392摇LiL,SunB,ZhangQJ.Ethnopharmacol.,2008,116(3):561-568

371-3763摇GoldsmithP,FentonH,Morris鄄StiffG,AhmadN,FisherJ,PrasadKR.J.Surg.Res.,2010,160(1):122-1324摇GUJin鄄Ning,NIUJun,PIZi鄄Feng,YUEHao,WUSui鄄Sheng,LIUShu鄄Ying.ChineseJ.Anal.Chem.,2013,41(3):5摇WUHong鄄Wei,GAOJian,LIShao鄄Jing,TANGLi鄄Ying,XUHai鄄Yu,TANGShi鄄Huan,YANGHong鄄Jun.ChineseJ.Anal.Chem.,2013,41(3):344-348

6摇ZhangXX,LiYB,ZhouHF,FanSM,ZhangZZ,WangL,ZhangYJ.J.Pharmaceut.Biomed.Anal.,2014,7摇LuXY,TianY,LianXP,JinYC,JinTT,ZhaoQQ,HuB,ShenXP,FanXH.FoodChem.Toxicol.,2014,8摇DudkaI,KossowskaB,SenhadriH,LatajkaR,HajekJ,AndrzejakR,Antonowicz鄄JuchniewiczJ,GancarzR.Environ.9摇KUANGYuan鄄Wen,WENDa鄄Zhi,ZHONGChuan鄄Wen,ZHOUGuo鄄Yi.ActaPhytoecologicaSinica,2003,27(5):709-717Int.,2014,68(7):71-8165(3):343-35597(11):151-156吴宏伟,高健,李韶菁,唐力英,许海玉,唐仕欢,杨洪军.分析化学,2013,41(3):344-348谷金宁,牛俊,皮子凤,越皓,吴绥生,刘淑莹.分析化学,2013,41(3):371-376

10摇LiuD,IslamE,LiTQ,YangXE,JinXF,MahmoodQ.J.HazardMater.,2008,153(1鄄2):114-12211摇LiTQ,DiZZ,YangXE,SparksDL.J.HazardMater.,2011,192(3):1616-1622

13摇YangJY,PanXL.J.PlantInteractions,2013,8(3):263-27012摇JiangCA,WuQT,ZengSC,ChenX,WeiZB,LongXX.J.EnvironSci.(China),2013,25(9):1890-189614摇HoaglandDR,ArnonDI.Circular.CaliforniaAgriculturalExperimentStation,347:1-3215摇SuzukiK,OkazakiK,TawarayaK,OsakiM,ShinanoT.SoilSci.PlantNutr.,2009,55(4):505-51316摇LisecJ,SchauerN,KopkaJ,WillmitzerL,FernieAR.NatureProtocols,2006,1(1):387-396

147(1):3-1117摇CarvalhaisLC,DennisPG.,FedoseyenkoD,HajirezaeiMR,BorrissR,vonWir佴nN.J.PlantNutr.SoilSci.,2011,18摇SelvakumarG,PanneerselvamP,GaneshamurthyAN,MaheshwariDK.BacterialMediatedAlleviationofAbioticStressinCrops.NewYork:Springer.,2012:205-224旷远文,温达志,钟传文,周国逸.植物生态学报,2003,27(5):709-717

MetabonomicsStudyonRootExudatesofCdHyperaccumulatorSedumAlfredii

1(SchoolofResourcesandCivilEngineering,NortheastUniversity,Shenyang110004,China)2LUOQing1,2,SUNLi鄄Na*2,HUXiao鄄Min1(KeyLaboratoryofRegionalEnvironmentandEco鄄RemediationofMinistryofEducatione,ShenyangUniversity,Shenyang110044,China)

Abstract摇Ametabonomicsmethodbasedongaschromatography鄄massspectrometry(GC鄄MS)wasdeveloped

fordetectingthesignificantdifferencesofrootexudatesoftheCdhyperaccumulatorSedumalfrediiunderCd.Therootexudateswerecollectedaftertreatmentfor4and8dayswith0and40滋mol/LCd.Thecollectedsolutionwaslyophilizedanddissolvedwithmethanol,andafterderivatizationwithmethoxyaminehydrochloride(PCA)andorthogonalpartialleast鄄squaresdiscriminationanalysis(OPLS鄄DA)werecarriedoutforpatternrecognitionandaclearseparationamongthedifferenttreatmentswasachieved.Twelvecompoundswhichtherelativeamountofthese12compoundsrevealeddifferenttrends,whichindicatedthattheCdhyperaccumulatorS.alfrediicouldadjustthesecretionofrootexudatestotolerateoraccumulatetheheavymetalCd.

spectrometrydifferenttreatmentsandstudytheeffectmechanismofS.alfrediitoleratingoraccumulatingtheheavymetalandN鄄methyl鄄N鄄trifluoroacetamide,thesampleswereanalyzedbyGC鄄MS.Principalcomponentanalysiscausedtheseparationamongthedifferenttreatmentswerefoundandidentified.Withthechangeoftreatments,Keywords摇Hyperaccumulator;Sedumalfredii;Rootexudates;Metabonomics;Gaschromatography鄄mass

(Received4May2014;accepted7July2014)ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.21037002,41071304,21107075)

柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿柿

国家自然科学基金委员会化学部2014年分析化学优秀中青年学者研讨会在穗举行

摇摇由国家自然科学基金委员会化学科学部主办、中山大学化学与化学工程学院承办的“2014年分析化学优秀中青年学者研讨会冶于11月21日至23日在广州胜利召开。出席会议的有基金委化学部梁文平副主任、分析化学学科庄乾坤主任,来自北京大学、清华大学、中科院化学所、香港浸会大学等单位的11名特邀专家,和来自全国56个高校、科研院所的20名分析化学领域“青年千人计划冶学者、28名“优秀青年基金冶获得者及其他一些优秀中青年学者等共计136人。

会上,庄乾坤主任首先介绍了近年来我国分析化学的基金资助情况、重大科研进展、人才培养和学科建设情况,以及我国学者的研究成果及其国际影响力,展望了分析化学的前沿发展趋势,会议还特邀张新荣教授报告了关于《AnalyticalChemistry》杂志的投、审稿情况及其注意事项等。在学术交流部分,共有51名分析化学优秀青年学者分别报告了他们的建设性的点评和建议。

最后,与会专家尤其是青年专家就基金委分析化学的“十三五冶发展战略、发展方向、学科建设和人才培养等重大问题,展开了富有建设性的讨论。他们认为,作为一门重要的基础学科,分析化学的研究应以“3S(Sensitivity,SelectivityandSpeediness)+2A(AccuracyandAutomatics)冶为杠杆,瞄准公认有影响的重大科学问题开展研究,要重视针对科学问题来研制新仪器装置、发展新技术和新方法,为解决重大科学问题提供强有力的分析方法和手段,充分发挥分析化学的学科优势。分析化学青年人才的培养是学科发展的重要工作,青年学者要相互团结、相互欣赏、相互支持、共同发展,在学术上应该勇于创新,敢于向关键性重大科学问题发起挑战,为推动我国分析化学研究向世界领先水平发展作出贡献。

本次会议是我国分析化学领域的一次高层次学术交流和战略研讨会,是对我国分析化学学科建设、人才培养及研究成果的集中展示与科学总结,将有力推动我国分析化学学科的发展。(李攻科供稿)研究成果及未来研究思路,特邀专家们从研究深度、创新性以及应用拓展等方面对各位青年学者的报告给予了针对性、