玉米赤霉烯酮毒素标准检测规程
玉米赤霉烯酮标准操作规程
1、
目的
为了规范亲和柱净化样本中玉米赤霉烯酮的操作流程,特制订本操作规程。 2、
范围
本标准适用于粮食、饲料、食品中玉米赤霉烯酮的检测。 3、
检出限和定量限
5.1 原理
测定的基础是抗原、抗体反应,抗体连接在柱体内,样品经过提取、过滤后,缓慢的通过玉米赤霉烯酮免疫亲和柱,在免疫亲和柱内毒素与抗体结合,之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱玉米赤霉烯酮,然后注入到高效液相色谱仪中用于检测。 5.2 溶液配制
5.2.1 提取液:80%乙腈
----用量筒移取800mL 乙腈,加入超纯水定容至至1L 。 5.2.2 稀释液:0.01M PBST 溶液
----称取8g NaCl、0.2g KCl、0.2g KH2PO 4 和1.16g Na2HPO 4.12H 2O ,加入800mL 超 纯水溶解,加入2mL Tween-20,定容至1L 。
5.2.3 玉米赤霉烯酮标准工作液:用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到1000 ng/ml、
500 ng/ml、200ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml。
5.3 样品前处理
----20g±0.01g 样品(固体样品需粉碎,并过2mm 分样筛)加入100mL 提取液(80%乙腈-水溶液)混匀;
----高速均质(≥10,000r/min)1min ,或摇床(200r/min~300r/min)剧烈振荡20min ,用快速定性滤纸过滤,收集滤液;
----取10mL 滤液加入40mL 稀释液稀释,再用微纤维滤纸过滤,并收集滤液作为上样液;
----取25mL 上样液过免疫亲和柱净化。 稀释倍数:1 5.4 净化
----取出免疫亲和柱,将上方塞子取出斜剪断,再插回亲和柱上;(3mL 的免疫亲和柱去掉上方塞子,安装上转接头,将转接头另一端与注射器固定后使用) ----将柱子与气控操作架上的注射器连接固定,取适量处理后的溶液上样; ----去掉亲和柱下方堵头,调节开关,使液体以1~2 滴/秒速度流出; ----待液体排干后,用10mL 去离子水洗涤2 次,流速2~3 滴/秒;
----待液体排干后,上样1mL 甲醇,流速1 滴/秒,收集洗脱液并定容至1mL ; ----洗脱液用0.22μm 微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC 分析。 * 每次上样前都要将上次液体完全排干。 * 谷物样本也适用于GB/T 5009.209-2008 5.5 液相测定 5.5.1 液相色谱条件
C18柱:250mm (长)×4.6mm (直径),填料粒径5μm; 流动相:60%乙腈 流速:1.0 mL/min; 柱温:40℃; 进样体积:20µL 荧光检测器 :
激发波长:274nm 发射波长:440nm
5.5.2 色谱定量
分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪,在上述色谱条件下测定试
样的响应值(峰高或峰面积),以标准品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标做标准曲线,将未知样本中玉米赤霉烯酮的峰面积带入标准曲线,得到试样中玉米赤霉烯酮的浓度,标准品色谱图参考下图:
数据文件名:ZEN-500ppb.lcd
样品名:ZEN-500ppb
mV
2520151050
附图:ZEN-500ppb 标准品液相图谱
5.6 注意事项
----使用前,免疫亲和柱需回至室温(22~25℃)。 ----亲和柱2~8℃储存,不得冻存。 ----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。
----取样量:根据需要可以适当增加或减少取样量,注意提取液量要相应改变。 ----柱容量:2000ng ,当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时,需要适当 降低上样液的体积,重新检测。
----pH :亲和柱的上样溶液pH 需在6~8 之间,若偏离此范围需要用盐酸或氢氧化钠调 节pH 。
----玉米赤霉烯酮可致癌,应戴手套操作。
----使用过的容器及标准品溶液最好用次氯酸钠溶液(5%V/V)浸泡过夜。 ----上机检测时的溶剂与流动相保持一致,可以消除溶剂效应的影响。 6、
相关文件
《免疫亲和柱检验标准》 《免疫亲和柱检验操作规程》 《岛津液相色谱仪标准操作规程》 《安捷伦液相色谱仪标准操作规程》 7、
相关记录 N/A 8、
附件 N/A
9、 修改历史记录