二代测序文库制备酶分析

T4 DNA Polymerase ，即T4 DNA 聚合酶，是一种模板依赖的DNA 聚合酶，可以在结合有引物的单链DNA 模板上，从5'→3'方向催化DNA 合成反应。T4 DNA Polymerase具有3'→5'外切酶活性，但不具有5'→3'外切酶活性。

特点：T4 DNA Polymerase由于同时具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性，可以用于将5' 端突出末端补平或3' 端突出末端削平。T4 DNA Polymerase的3'→5'DNA外切酶活性对于单链DNA 要比双链DNA 活性更高，即单链DNA 要比双链DNA 中的非配对链部分更容易被T4 DNA Polymerase所消化。T4 DNA Polymerase的3'→5'外切酶活性比Klenow Fragment 要高约200倍。

用途：T4 DNA Polymerase可用于催化以下反应：DNA 5'或3' 突出末端的平滑化；通过置换反应进行标记DNA 探针合成；定点突变过程中第二链的合成；不依赖于连接反应的PCR 产物克隆。

来源：本T4 DNA Ligase由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。

活性定义：37℃30分钟时间内，催化10nmol 脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。

活性检测条件：67mM Tris-HCl(pH8.8)，6.7mM MgCl2，1mM DTT，16.7mM(NH4) 2SO 4，0.2mg/ml BSA，0.033mM of each dNTP，0.4MBq/ml[3H]-dTTP，0.2mM 热变性且经DNA 酶部分消化过的小牛胸腺DNA 。

纯度：不含DNA 内切酶，不含RNase 。

酶储存溶液：20mM potassium phosphate(pH7.5)，200mM KCl，2mM DTT，and 50% glycerol。 Reaction Buffer(5X)：335mM Tris-HCl(pH8.8 at 25℃) ，33mM MgCl2，5mM DTT，84mM (NH4) 2SO 4。

缓冲液兼容性：在碧云天的内切酶反应缓冲液1X O、1X R、1X Y、2X Y中的活性为100%，在1X B、1X G中的活性为75-100%。

失活或抑制：70℃加热10分钟可使T4 DNA Polymerase失活。金属离子螯合剂可以抑制T4 DNA Polymerase的活性。

T4 Polynucleotide Kinase，简称T4 PNK，中文名称T4多聚核苷酸激酶，是一种多聚核苷酸5' 羟基激酶，可以催化ATP 的γ位磷酸基团向单链或双链DNA 、RNA 、寡核苷酸或带有3' 磷酸基团的单核苷酸的5' 羟基转移。其他NTP 也可产生相同的反应：5'-OH + NTP → 5'-P + NDP 。

上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP 并且存在ADP 的情况下，T4 Polynucleotide Kinase 可以显示出5' 磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA 、RNA 、寡核苷酸或带有3' 磷酸基团的单核苷酸的5' 磷酸基团向ADP 的转移形成A TP 。其他NTP 也可产生相同的反应：5'-P + NDP → 5'-OH + NTP(最适pH 为6.4左右) 。

当ATP 和ADP 都适量存在时，T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA 、RNA 、寡核苷酸或带有3' 磷酸基团的单核苷酸的5' 磷酸基团和ATP 的γ位磷酸基团之间的交换反应。其他NTP 也可产生相同的反应：5'-P + NTP + NDP→5'-P + NDP + NTP。

T4 Polynucleotide Kinase同时具有3' 磷酸酯酶活性，可催化3' 磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3'-P → 3'-OH + Pi(最适pH 为5.9左右) 。

T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近。 用途：寡核苷酸、DNA 或RNA 的5' 末端标记，用作Southern 、Northern 、EMSA 等的探针，凝胶电泳的marker ，DNA 测序引物，PCR 引物等；使寡核苷酸、DNA 或RNA 的5' 端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；催化3' 磷酸化的单核苷酸的5' 磷酸化，使该单核苷酸可以和DNA 或RNA 的3' 末端连接；去除3' 端磷酸基团。

来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。

活性定义：37℃30分钟内，将转移ATP 上1 nmol γ-磷酸基团转移到DNA 5'-OH末端所需的酶量定义为1个活性单位。

酶活性检测条件：100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl2，5mM DTT，0.5mM 5'-OH DNA，0.05mM ATP，0.1MBq/ml [γ-33P]-ATP。

纯度：不含DNA 内切酶和外切酶，不含RNA 酶。

酶储存溶液：20mM Tris-HCl(pH7.5)，25mM KCl，0.1mM EDTA，2mM DTT，50% glycerol。 Reaction Buffer A(10X)(用于磷酸化反应) ：500mM Tris-HCl(pH7.6 at 25℃) ，100mM MgCl 2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA。

Reaction Buffer B(10X)(用于交换反应) ：500mM imidazole-HCl(pH6.4 at 25℃) ，0.18M MgCl 2，50mM DTT，1mM spermidine，1mM EDTA，1mM ADP。

缓冲液兼容性：在碧云天的内切酶反应缓冲液1X G、1X O、1X Y、2X Y中的活性为100%，在1X B、1X R中的活性为75-100%；在碧云天的Taq 、Pfu DNA polymerase和M-MuLV 反应缓冲液中的活性为50-100%。

失活或抑制：75℃加热10分钟可使T4 Polynucleotide Kinase失活，加入EDTA 也可使T4 Polynucleotide Kinase 失活。金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于50mM 的KCl 和NaCl 均可显著抑制T4 Polynucleotide Kinase的活性。

Klenow Fragment，又称Klenow 片段，是大肠杆菌聚合酶I(E.coli.DNA polymerase I)的大片断(Large Fragment) 。Klenow Fragment保留了DNA 聚合酶I 的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，但缺少完整的Klenow 酶的5'→3'外切酶活性。Klenow Fragment的3'→5'外切酶活性保证了其合成DNA 时的准确性(proofreading)。

特点：对于5' 突出或3' 突出的粘末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接。 用途：双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的补平(fill-in)；双链DNA 3'突出(3'overhang)的打平(也称削平) ；5' 突出末端的标记；随机引物法进行DNA 标记；Sanger 双脱氧法进行DNA 测序；cDNA 第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。

来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为polA 基因片段。

分子量：约68kDa(单体) 。

活性定义：37℃30分钟时间内，催化10nmol 脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。

酶活性检测条件：67mM potassium phosphate(pH7.4)，6.7mM MgCl 2，1mM 2-mercaptoethanol ，0.033mM dATP ，0.033mM dTTP ，0.4MBq/ml[3H]-dTTP，62.5μg/ml poly(dA-dT)·poly(dA-dT)。

纯度：不含DNA 内切酶，不含RNase 。

酶储存溶液：25mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mM EDTA，1mM DTT，50%(v/v)glycerol。 Reaction Buffer(10X)：500mM Tris-HCl(pH8.0 at 25℃) ，50mM MgCl2，10mM DTT。 缓冲液兼容性：在碧云天的内切酶反应缓冲液1X O、1X R、1X Y、2X Y中的活性为100%，在1X B、1X G中的活性为100%；在碧云天的Taq 、Pfu DNA polymerase和M-MuLV 反应缓冲液中的活性为100%。

失活或抑制：75℃加热10分钟或加入适量EDTA 均可导致Klenow Fragment失活。金属离子螯合剂，无机焦磷酸盐(PPi)，大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment 有抑制作用。

Klenow Fragment (3´→ 5´ exo –)

用随机引物制备探针

随机引物标记法

合成 cDNA 第二链

诱变反应中第二链的合成（2）

双脱氧法 DNA 序列测定（Sanger 法）（3）

概述：

Klenow 片段(3´→5´exo ) 是大肠杆菌DNA 聚合酶I 的蛋白水解产物。同大肠杆菌DNA 聚合酶I 一样，具有5´→3´的DNA 聚合酶活性，但失去了5´→3´外切核酸酶活性。该酶经突变(D355A, E357A) 去除了其3´→5´的外切核酸酶活性(1) 。 -

来源：

重组E. coli菌株，其携带的质粒上含有E. colipolA（D355A ，E357A ）基因的片段，片段起始位置在密码子 324 处。

反应条件：

1X NEBuffer 2 [50 mM NaCl ，10 mM Tris-HCl ，10 mM MgCl 2，1 mM DTT （pH 7.9 @ 25 ℃）]。加入 dNTPs （不随酶提供）。

当添加 dNTPs 后，Klenow 片段（3' →5' exo-）在所有的 NEB 限制性内切酶反应缓冲液中都有活性 单位定义：

1单位指在37°C 条件下，30分钟内能使10 nmol 的dNTPs 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。 热失活：

75°C 20分钟。

使用注意事项：

Klenow 片段(3´→5´exo ) 因去除了3´→5´外切酶的活性，故不适宜用于生成平末端的反应。当用于双脱氧法DNA 序列测定时(Sanger法) ，建议用1 unit/5 μl反应体系。

(2)-

T4 DNA Ligase 即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA 或RNA 的5’-P 末端和3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP 作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA 、双链RNA 或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。 用途：T4 DNA Ligase常用于DNA 片段和载体、linker 或adaptor 等的连接。也可以用于缺刻修复及Ligase 介导的RNA 检测。

来源：本T4 DNA Ligase由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。

活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16℃ in 20 μl of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA and a 5'-DNA termini concentration of 0.12 μM(300 μg/ml)。200U 等于1个Weiss unit，以Weiss unit计，本产品共1000单位。

纯度：不含DNA 内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA 酶，满足常规连接反应要求。 酶储存溶液：20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50%(v/v)glycerol。

10X Ligation Buffer：400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP。 失活或抑制：65℃孵育10分钟可以导致T4 DNA Ligase失活；NaCl 或KCl 浓度大于200mM 时强烈抑制T4 DNA Ligase。