真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定
675-678广西农业科学2010，41（7）：
GuangxiAgriculturalSciences
·675·
真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物
病原真菌的拮抗活性测定
汪
（1广西大学农学院，南宁
茜1，2，胡春锦2，3，黄思良4*，柯仿钢1，黎起秦1
530007；3广西作物遗传改良生物技术重点开
473061）
530007；4南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳
530005；2广西农业科学院微生物研究所，南宁
放实验室，南宁
摘要：针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害，对柑橘、香蕉、甘蔗、辣椒、药用植物等作物根际土壤进行拮抗菌筛选试验。结果从不同作物根际土壤中共分离得到386株菌株，其中有拮抗作用的34株，平皿拮抗效果较好的16株；再经复筛，得到一株对柑橘炭疽菌有较好抑制效果的拮抗菌Bs55；对峙培养试验表明，Bs55菌株对12种常见病原真菌具有较强的抗菌活性，抑菌率最高达87．7％。拮抗菌Bs55具有拮抗作用强、能大量繁殖、抑菌谱广等特点，是具有较好利用前景的生物防治材料。
关键词：Bs55菌株；枯草芽孢杆菌；病原真菌；拮抗活性中图分类号：S476+.1
文献标识码：A
文章编号：1002－8161（2010）07－0675－04
Screeningofantagonisticbacteriaagainstfungaldiseasesanddeterminationoftheirantagonisticactivitytovariousplant
pathogenicfungi
WANGQian1，2，HUChun－jin2，3，HUANGSi－liang4*，KEFang－gang1，LIQi－qin1
(1AgriculturalCollege,GuangxiUniversity,Nanning530005,China;2MicrobiologyResearchInstitute,GuangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanning530007,China;3GuangxiCropGeneticImprovementandBiotechnologyLab,Nanning530007,China;4CollegeofLifeScienceandTechnology,NanyangNormalUniversity,Nanyang,Henan473061,China）
Abstract:Inordertofindouttheantagonisticbacterialagentsagainst12kindsofcropfungaldiseasesoccurringcommonlyinGuangxi,screeningexperimentswerecarriedoutusingbacteriafromrhizosphericsoilofcitrus,banana,sug-arcane,pepperandsomemedicinalplants.Thestudiesresultedinisolationof386strainsfromrhizosphericsoilofdifferentcrops.Amongthese,34strainsshowedantagonisticactivityand16strainsshowedgoodantagonisticeffectsonplate.Aftersecondaryscreening,antagonisticbacterialBs55wasscreenedoutwithstronginhibitoryeffectoncitrusanthracnose.Con-frontculturetestsshowedthatBs55strainhadstrongantifungalactivityto12kindsofcommonpathogenicfungis,thehigh-estinhibitingratereached87.7%.Ithasthecharacteristicsofstrongantagonismandlargescalepropagation,andwasap-provedtobeapromisingbiocontrolagentwithabroad-spectrumbiocontrolpotential.
Keywords:Bs55strain;Bacillussubtilis;pathogenicfungi;antifungalactivity
真菌病害是阻碍植物生长、影响作物产量的主要病害［1］，给农业生产带来了严重危害。土壤是各种微生物良好的栖息场所，生存着许多具有相互拮抗作用的微生物。在生防菌株的筛选上，考虑到植物与微生物之间的相互作用关系，人们把重点放在从植物根表面或根际土壤中筛选，这样筛选出的微生物接种后在植物根表面具有很好的定殖能力［2］。
本研究针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害，从不同作物根际土壤中筛选拮抗菌，为开发广西微生物资源，筛选与环境相容性好的微生物农药奠定基础。
1
1．1
材料与方法
供试病原菌和培养基
收稿日期：2010－04－19基金项目：广西农业科学院科技发展基金重点项目［2007007（Z）］作者简介：汪茜（1984－），女，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向为真菌学及植物真菌性病害防治。*为通信作者，E－mail：silianghuang＠
126．com。
·676·
广西农业科学
供试病原菌有柑橘炭疽病菌［Colletotrichumgloeosporioides（Penz．）Sacc．］、水稻纹枯病菌（Rhi-zoctoniasolaniKühn）、玉米大斑病菌［Exserohilumturcicum（Pass．）Leonard＆Suggs］、玉米小斑病菌［Cochliobolusheterostrophus（Dreschl．）Dreschl．］、茉莉白绢病菌（SclerotiumrolfsiiSacc．）、辣椒炭疽病菌［Colletotrichumgloeosporioides（Penz．）Sacc．］、香蕉炭疽病菌［Colletotrichummusae（Berk．＆Curt）Arx］、冬瓜疫霉（PhytophthoradrechsleriTucker）、龙眼链格孢黑斑病菌［Alternariaalternata（Fr．）Keissler］、香蕉大灰斑病菌［Curvularialunata（Wakker）Boedi-jin］、香蕉叶缘枯斑病菌（AlternariamusaeBour．etBat）、杨桃炭疽病菌［Colletotrichumgloeosporioides（Penz．）Sacc．］等12种，均由广西农业科学院微生物研究所保存、提供。菌株在PDA培养基上28℃活化
培养后供试。
拮抗菌分离培养基采用NA培养基［3］（牛肉浸膏
10g、蛋白胨5g、葡萄糖20g、琼脂15g、水1000mL，
pH7．0～7．2），拮抗菌筛选培养基采用PDA培养基（马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂15g、水1000mL）。1．2拮抗菌的分离
从广西农业科学院、南宁市金陵镇、金光农场、广西大学农场和广西药用植物园等地采集柑橘、香蕉、甘蔗、辣椒、药用植物等不同种类作物根际土壤，分别称取土壤10g，放入90mL有玻璃珠的无菌水三角瓶中，200rpm摇匀20min，制成土壤悬浮液，梯度稀释成10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。用接种环从10－3、
10－4悬浮液中各沾取1环，分别在平板上划线［4］，于28℃下倒置培养，48h后观察，挑取不同形态单菌
落，纯化后保存，待测。
1．3拮抗菌的筛选
1．3．1初筛以柑橘炭疽病菌为测试菌进行拮抗菌初筛。将直径5mm的病菌原菌块置于PDA平板中央，在其周围4个等距离位置上分别点接4种不同的细菌，每处理3次重复。培养3～5d后，观察不同细菌是否对致病菌生长有抑制作用及抑菌带的大小（取
3次重复的平均值），并按抑菌圈半径的大小将拮抗菌分为强、中、弱三类，抑菌圈半径＞10mm为强，5～10mm为中，＜5mm为弱。
1．3．2复筛将有抑菌作用的菌株作进一步筛选。采用平板对峙法［5］，在培养皿中央接种培养7d的柑橘炭疽病菌菌饼（直径5mm），离该菌饼约3cm处，用接种环沾取培养48h的拮抗菌，在平板对称两侧各划一条细线，28℃培养，以只接种病原菌
的平板为对照，待对照长满皿时测量柑橘炭疽病菌的菌落生长直径，每处理重复3次。按下式计算菌落生长抑制率：
菌落生长抑制率＝(对照菌落净生长距离-处理
菌落净生长距离)/对照菌落净生长距离×
100%
1．3．3
拮抗菌对多种病原真菌抑菌力测定
采用
平板对峙法，将菌株Bs55在PDA培养基平板上划线，距划线处4cm接种病原菌菌饼（直径5mm），
28℃培养，以仅接种病原菌的平板为对照，待对照
长满皿后测量病原菌的生长直径，计算抑制率。每处理重复3次。
2结果与分析
2．1
拮抗菌的分离筛选
从不同作物根际土壤中共分离得到386株菌株，其中有拮抗作用的34株，平皿拮抗效果较好的16株；再经过复筛，得到一株拮抗活性最强的细菌Bs55。Bs55分离自广西药用植物园鸡血藤根际土壤，经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。
以柑橘炭疽病菌为单一靶标菌与所有分离菌株进行对峙培养，结果显示，不同类群的微生物出现拮抗菌株的频率各有不同，其中25株放线菌中有4株对柑橘炭疽病菌具拮抗作用，拮抗菌株检出率为16.0％（表1）；不同类别作物根际分离物中拮抗菌的检出率也不同，其中甘蔗根际拮抗菌株的检出率最高，为12．5％，其次为柑橘9．7％，玉米根际的拮抗菌检出率最低，为3．1％（表2）。
表1不同类群微生物中拮抗菌株的检出率
Table1Detectionrateofantagonisticstrainsindifferentgroupsofmicroorganism
微生物类群测试菌株数拮抗菌株数
NumberoftestNumberof
比率(%)
Microbegroupstrainsantagonisticstrains
Percentage
细菌Bacteria356308.4放线菌Actinomycete25416.0真菌Fungi
5
表2不同类别作物根际拮抗菌株出现频率
Table2Occurrencefrequencyofantagonisticstrainsincroprhizosphereofdifferentcrops
作物类别分离菌株数拮抗菌株数拮抗菌株出现率（％）CropcategoryNumberofNumberofOccurrencefrequencyisolatedstrainantagonisticstrainofantagonisticstrains
柑橘Citrus6269.7香蕉Banana4848.3甘蔗Sugarcane64812.5辣椒pepper5036.0玉米Maize3213.1
药用植物
Medicinalplants
130
12
9.2
汪茜等：真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定
·677·
2．2
拮抗菌对多种病原真菌抑菌力测定
采用平板对峙法检测Bs55对12种病原真菌的
抑制效果。结果显示（表3），Bs55菌株对供试的12种病原菌表现出较高的抑菌活性，抑菌率在59．9％～
87．7％之间，表明生防菌Bs55对不同病原真菌的抑菌力虽然存在明显差异，但有较广的抑菌谱。Bs55菌株对部分病原真菌的抑菌效果见图1。
A：柑橘炭疽病菌；B：玉米小斑病菌；C：玉米大斑病菌；D：香蕉大灰斑病菌A:C.Gloeosporioides;B:C.heterostrophus;C:E.turcicum;D:C.LunataFig.1
图1Bs55菌株对部分病原真菌的抑制作用
InhibitoryeffectsofBs55strainagainstsomepathogenicfungi
表3Bs55菌株对12种植物病原真菌的抑菌率
Table3InhibitoryratesofthestrainBs55against12kindsofplantpathogens
病原菌Pathogen柑橘炭疽病菌C.gloeosporioides水稻纹枯病菌R.solani
玉米大斑病菌E.turcicum玉米小斑病菌C.heterostrophus辣椒炭疽病菌C.gloeosporioides茉莉白绢病菌S.rolfsii
香蕉炭疽病菌C.musae
杨桃炭疽病菌C.gloeosporioides香蕉大灰斑病菌C.lunata冬瓜疫霉P.melonis
香蕉叶缘枯斑病菌A.musae
龙眼链格孢黑斑病菌A.alternate
抑菌率(%)差异显著性SignificantdifferenceInhibitoryrate5%1%
87.787.177.461.386.386.686.364.259.985.979.574.9
aacfaaaefabd
AABEAAADEABC
3结论与讨论
微生物在自然界的分布非常广泛，地球上除了
火山区域外，无论是土壤、空气、水、枯枝烂叶、植物病株、腐烂果实等都含有众多微生物［7~9］。Filonow等［10］不从苹果上分离拮抗菌，而以从其他生境如空气、土壤、海水、叶片、大蒜等上分离到的28种酵母为材料，筛选到能有效防治苹果灰霉病的土生隐球酵母（CryptococcushumicolaNRRLY1266）、花状线
黑粉菌（FilobasidiumfloriformeNRRLY7454）、红冬孢酵母（RhodosporidiumtoruloidesNRRLY1091）、掷孢酵母（SporobolomycesroseusFS－43－238）等几种酵母。可见，拮抗菌的筛选不是教条的，只要有抑菌效果且无害，都可以利用。
枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在［11~13］，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点［14~18］。美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局（EPA）商品化或有限商品化生产应用许可，它们分别是GBO3、MBI600、QST713和解淀粉枯草芽孢杆
注：抑菌率为3次重复的平均值；大、小写字母分别表示1％和5％水平上的差异显著性。
Note：Valuesofinhibitoryratesareaverage；differentcapitalandsmallalphabetsinthesamecolumnrepresentsignificantdifferenceat0．01and0．05level，respectively．
·678·
广西农业科学
菌变种（B．subtilisvar．amyloliquefaciensFZB24），其中生物杀菌剂QST713为AgraQuest公司产品，商品名为Serenade，主要用于防治水果采收前后病害［19］。我国林开春等
［20］
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［11］ObagwuJ，KorstenL．Integratedcontrolofcitrusgreen
公布的含有枯草芽孢杆菌CCTC
［21］
CM204085的防腐保鲜剂（公开号：1853489）在果实
采后防腐保鲜方面的应用效果较好。杨佐忠等达到了较好的防腐保鲜效果。
利
用枯草芽孢杆菌PRS5处理采后的苹果和脐橙，也
本研究从所采集土样中分离纯化出的386株菌株中，通过多步筛选，得到对12种病原真菌抑制效果最强的枯草芽孢杆菌Bs55作为目标拮抗菌。Bs55对12种病原真菌均表现出显著的抑制作用，抑菌率均在59．9％以上，最高达87．7％，具有广谱抑菌活性，但对病原真菌的抑制力各有侧重。目前有很多关于利用生防细菌防治植物真菌病害的报道，但从整体上看主要存在防治谱窄的问题［2］
。另外，生防菌发挥生防作用还涉及其在不同土壤环境中的定殖。本研究从广西红壤土类型、气候条件、强紫外线条件下筛选出的拮抗菌Bs55具有拮抗作用强、能大量繁殖等特点，其菌株本身具有广谱生防潜力，是有较好利用前景的生物防治材料。因此，生防菌Bs55具有很好的工业开发前景和应用价值，有必要对其菌株本身及其抑菌机理进行深入研究。
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（责任编辑麻小燕）
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