微生物,真菌实验
青 岛 农 业 大 学
兽医微生物学课程论文
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病原真菌的分离鉴定 动物科技学院 动物医学 2014年 4 月 13 日
病原真菌的分离鉴定
动医1205 李春成20121450
摘要：制作固体培养基，将A 、B 、D 三种真菌接种到培养基和盖玻片上进行3-5d 的培养（温度为28℃，观察真菌在固体培养基上的生长表现，在显微镜下观察小培养中的真菌形态，用美蓝染色液染酵母菌，进一步观察其形态。
关键词：真菌；分离；形态；接种
引言：
真菌在自然界分布广、数量大、种类多。有些真菌可引起人和畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接的危害人类和动物健康。了解真菌的培养方法，认识其形态十分重要。
真菌中的酵母菌是单细胞微生物，细胞核和细胞质有明显的分化，个体直径比真菌大10倍左右，多为圆形或卵圆形。酵母菌无性繁殖主要是出芽生殖，在特殊的情况下能形成假菌丝，有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。用美蓝染色液制成水浸片，不仅可以观察其外形，还可以区分死活细胞。
霉菌的营养体是分支的丝状体，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝又分化出繁殖菌丝，不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。
霉菌的菌丝较大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以指标本是常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长的时间，溶液本身呈蓝色，有一定的染色效果。
利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态。
制作霉菌封闭标本，一般用石炭酸棉染色液封片，其中含有甘油，不易干燥，石炭酸有防腐作用，棉蓝有一定的染色作用，便于观察。
1材料和方法
1.1材料
待鉴定的三种真菌A 、B 、D
1.1.1培养基
PDA 培养基
1.1.2仪器
悬液、载玻片、盖玻片、无菌培养皿、湿盒，1mL 无菌注射器、生理盐水、酒精灯等
1.2方法
1.2.1划线分离：将接种环经火焰灭菌冷却后，取待测的真菌，按照细菌的平板划线分离法进行平板划线，即用接种环从待测培养基上蘸取菌种在平板上划1/5-1/4，划毕灼烧灭菌接种环，待冷却后，于第二段处再做划线，且从第一段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。冷却后，于第三段再做划线，且从第二段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。冷却后，于第四段再做划线，且从第三段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。
1.2.2小培养：用注射器吸取液体培养基于载玻片上，将接种环在火焰下灭菌，挑取待检菌放于液体培养基上，待液体培养基将要凝固，但仍有部分呈液体状时，盖上盖玻片，标记好菌种。
1.2.3酵母菌水浸片的制备：先取干净的载玻片滴上生理盐水1-2滴，将接种环在火焰下灭菌，挑取酵母菌少许，均匀涂在液滴中，再将美蓝染色液滴于载玻片上，染色2-3min 后加盖玻片。（注意切勿产生气泡）然后低倍镜和高倍镜观察其细胞形态、芽殖方式。
2. 结果与分析
2.1观察三个培养基：A 菌在固体培养基上菌落呈油脂状，表面光滑、湿润、粘稠，颜色呈黄色。B 菌在固体培养基上菌落为毡状，颜色是绿色，具有典型的放射状皱纹。D 菌在固体培养基上菌落密集，最初呈白色，孢子呈黑色。
2.2实验现象
2.2.1小培养形态鉴定现象
前三图均在40X 下观察）
A 菌体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。光镜下可见细胞质所在范围及细胞壁的影子，高倍镜中可现细胞核。B 菌菌丝呈无色，有分隔，其分生孢子梗经过多次分支，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为扫帚体。D 菌菌丝无隔，有匍匐菌丝和假根，假根着生处有直立向上孢子囊梗，其顶端彭大成孢子囊，孢子囊底部有半球形囊轴。
2.2.2美兰染色现象
显微镜下看到的是单细胞, 不形成菌落的真菌，无色细胞为活
酵母菌细胞，蓝色细胞为已死的酵母菌细胞。
3. 讨论
本次试验做的还可以，试验结果都能看到，现象比较明显，不过，显微镜聚焦不是很好，看的不是很清楚，现象也不太明显，在做小培养时充分发挥了团队合作精神，使得试验做的很快（因为做小培养时，液体培养基温度不那么高了，凝固时间很快），做美兰染色时，也很注意没有弄进气泡，不影响观察。
4. 结果
经以上试验可得出，A 为酵母菌；B 为青霉菌；D 为根霉菌。
4. 参考文献
兽医微生物实验教程 胡贵学 2006