Fmoc保护氨基酸与Wang树脂的缩合反应
Vo. l 29
2008年9月
高等学校化学学报
CHEM I CAL J OURNAL OF CH I NESE UN I VERSI T I E S
No . 9
1769~1772
F m oc 保护氨基酸与W ang 树脂的缩合反应
郑彦慧, 张艳平, 张 浩, 马玉新
1
1
1
1, 2
, 路延龄
1, 2
, 史作清
1, 2
(1. 天津南开和成科技有限公司, 2. 南开大学化学学院, 天津300071)
摘要 研究了保护氨基酸、W ang 树脂取代度、树脂粒度、搅拌方式对Fm oc -氨基酸-W ang 树脂连接效率的影响. 结果表明, 保护氨基酸分子量的大小会因产生不同的位阻而影响缩合反应的效率, 分子量越小缩合效率越高; W ang 树脂的取代度较高时, 已缩合的氨基酸给后续保护氨基酸的缩合形成阻碍, 使缩合效率降低; 粒径较小和搅拌较好时, 对保护氨基酸的粒内外扩散有利, 可提高反应速度和缩合效率. 关键词 固相多肽合成; W ang 树脂; Fm oc 保护氨基酸; 活化酯法
中图分类号 O 621. 3 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2008) 09-1769-04
自从20世纪60年代, M errifield 教授
[1]
发明固相多肽合成以来, 经过40多年的发展, 固相多肽合
[2]
成已经发展成为多肽化合物制备的重要手段, 并且已经大规模地用于多肽类药物的工业化生产. 在
固相多肽合成中, 所用氨基酸的N -端保护有叔丁氧羰基(Boc) 和芴甲氧羰基(Fm oc) 两种策略. 在Boc 策略中, 合成过程需要频繁使用三氟乙酸(TFA) 进行脱保护, 最后将肽从载体树脂上裂解下来也需使
[3]
用氟化氢(HF)气体, 操作不便; 而Fm oc 策略中, 合成过程中用温和的有机碱(六氢吡啶) 进行脱保护, 最后肽的裂解仅需使用一次三氟乙酸(TFA) 溶液, 操作简便
采用这两种策略合成的肽从纯度和收率相比并无太大差别
[4]
.
[5]
, 所以采用Fm oc 策略进行肽合成得
到越来越广泛地应用.
Fm oc 采用策略合成的第一步是将一个Fm oc 保护的氨基酸的羧基通过酯键或酰胺键连接到载体树脂上, 这一步连接效率的高低不仅直接影响到后面氨基酸的用量, 也直接影响到目标肽的收率. 因此, 在固相多肽合成中, 第一步连接效率的研究非常重要.
本研究采用N, N -二异丙基碳二亚胺(D I C ) 代替常用的二环己基碳二亚胺(DCC ), 因为前者在反
[6]
应中形成的脲盐副产物溶解性比后者要好, 较容易洗除. 尽管二甲基甲酰胺(DMF) 对Fm oc -氨基酸和缩合试剂均具有溶解度高的优点
[8]
[7]
, 但是DMF 对采用D I C 与二甲氨基吡啶(DMAP) 催化的羟基树
[9]
脂与F m oc 氨基酸的成酯反应有抑制作用, 而二氯甲烷(DC M ) 在成酯反应中对D I C -DMAP 催化的反应系统则是良好的溶剂, 故此, 本研究采用DC M 为溶剂, 以广泛使用的W ang 树脂作为固相合成载体, 用活化酯法进行Fm oc 保护氨基酸与树脂的缩合反应(Sche m e 1). 探讨了相同条件下带不同保护基的氨基酸与树脂的缩合反应效率; 还分别探讨了不同的反应条件下, 保护氨基酸的种类、W ang 树脂的取代度、树脂的粒度、反应的搅拌方式等因素对缩合反应效率的影响.
Sch e m e 1 R eaction of Fmoc -a m ino acids w ith W ang resi n
收稿日期:2008-01-16.
联系人简介:马玉新, 男, 博士, 副教授, 主要从事有机和物理化学研究. E-m ai:l yxma @nanka. i edu . cn
1770
高等学校化学学报 V o. l 29
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
UV-754型紫外-可见分光光度计; 盛华牌SH Z -82型台式恒温摇床; D2004W 型数字电动搅拌器. W ang 树脂(交联度1%的DVB , 天津南开和成科技有限公司); 1-羟基苯并三氮唑(HOBt), Fm oc -氨基酸(上海吉尔生化公司); D I C(淄博天堂山试剂厂); DMAP(湖南海利高科化工厂); 吡啶(天津瑞金特化学品公司); 六氢吡啶(天津南开精细化工研究所); 乙酸酐、DC M 及DM F(天津化学试剂一厂); 以上试剂均为分析纯. DMF 用前经减压重蒸, 用014n m 分子筛干燥储存; DC M 用前用无水碳酸钾干燥24h 以上.
1. 2 实验过程
用DC M 预溶胀树脂30m in , 滤去溶剂备用; 将Fm oc -氨基酸(215mm o l) 及HOBt(215mm o l) 溶于DC M 中, 然后加入D I C (215mmo l), 搅拌10m i n ; 再加入已溶胀好的W ang 树脂(110mm ol), 加入D MAP(011mm o l), 密封反应容器, 控温25~28e 反应15h . 停止反应, 滤去反应液, 用DMF 洗涤树脂2次, 滤去DMF; 依次加入DC M (溶剂) 、乙酸酐(5mmo l) 、吡啶(5mmo l), 密闭反应容器, 控温25~28e 反应1h , 用DC M 洗涤树脂. 1. 3 Fm oc -氨基酸连接W ang 树脂的取代度检测
按照M arkus Gude 等的方法进行取代度的检测和计算. 1. 4 树脂缩合反应效率计算
理论取代度(mmo l/g)=
W ang 树脂的取代度@1000
1000+W ang 树脂的取代度@(保护氨基酸分子量-18)
实测取代度
缩合反应效率=@100%
理论取代度
[10]
2 结果与讨论
2. 1 不同的保护氨基酸对缩合反应效率的影响
4种保护氨基酸与同一批W ang 树脂(取代度1. 0mm o l/g)在相同条件下反应, 结果见表1.
Table 1
Fm oc -a m i no aci d Fm oc -A rg(Pb f)-OH Fm oc -Cys(Trt )-O H Fm oc -Ser(t -Bu )-OH
Fm oc -G l y -O H
M ol ecu l ar w ei gh t
648. 8585. 7383. 4297. 3
Inf l uence of F m oc protec ted a m ino acids
Loading of F m oc -a m i n o acid -W ang resi n /(mmol #g -1)
0. 370. 450. 60
0. 75
R eacti on effici en cy(%)
60. 370. 581. 995. 9
从表1数据可看出, 在所用W ang 树脂和缩合方法相同时, 缩合反应效率随连接的保护氨基酸分子量的增大而降低. 这是因为保护氨基酸的侧链基团结构不同造成的(Sche m e 2). 侧链基团大小的排列顺序为A r g >Cys>Ser>G ly(无侧链). 由于W ang 树脂与保护氨基酸的缩合反应是非均相(固液两相) 反应, 保护氨基酸侧链基团越大, 它的空间位阻越大, 反应活性就越低, 连接效率越低; 同时保护氨基酸侧链基团越大, 位阻的影响使其在反应过程中向W ang 树脂内部扩散的速度越慢, 进入树脂内部网格与反应基团接触的几率越少, 也会造成连接效率的降低
.
Sche m e 2 S i d e chain struc ture of F m oc -a m i no ac i d s
N o . 9
郑彦慧等:Fm oc 保护氨基酸与W ang 树脂的缩合反应1771
2. 2 W ang 树脂取代度对缩合反应效率的影响
3批取代度不同的W ang 树脂与3种保护氨基酸在相同条件下反应, 结果见表2.
Table 2
Load i ng ofW ang res i n a /(mmol #g -1)
Load i ng of Fmoc -A rg(Pb f)-W ang res i n b /(mmol #g -1) Reaction effici en cy (%)
Load i ng of Fmoc -Lys(Boc)-W ang res i n c /(mm ol #g -1) Reaction effici en cy c (%)
Load i ng of Fmoc -Ile -W ang res i n d /(mmol #g -1) Reaction effici en cy d (%)
b
Influence of the l oad i ng ofW ang resi n
0. 840. 3461. 9
0. 5082. 10. 5888. 5
1. 00. 3760. 3
0. 6972. 50. 5674. 8
1. 260. 3144. 2
0. 5770. 90. 5966. 6
a. Fm oc -Am i no aci d ; b . Fm oc -A rg(Pb f)-OH; c . F m oc -Lys(Boc)-OH; d. F m oc -Ile -O H.
从表2数据可以看出, 在与W ang 树脂缩合反应过程中, 同一种保护氨基酸的缩合反应效率随W ang 树脂取代度的增大而降低. 这是因为随着W ang 树脂取代度的增大, 树脂在DC M 中的溶胀度变小, 树脂内部空间网格变得拥挤, 树脂内部空间反应活性点密度变大, 由于位阻的影响已缩合的氨基酸对树脂内邻近的其它反应活性点有掩蔽, 给后续保护氨基酸的缩合造成阻碍, 使缩合效率降低. 2. 3 搅拌方式对缩合反应效率的影响
同一批W ang 树脂(取代度1. 0mm o l/g)分别与两种保护氨基酸及采用两种搅拌方式进行反应(其它反应条件相同), 结果见表3.
Table 3 E ffec t of sti rr i ng m od es on the reac ti on effic iency
Fm oc -a m i no aci d Fm oc -Leu -O H Fm oc -A s p (Ot Bu)-O H
S tirri ng m ode Sh ak i ng tab le(200r/mi n ) M echan i cal stirri ng(300r/min) Sh ak i ng tab le(200r/mi n ) M echan i cal stirri ng(300r/min)
Load i ng of F m oc -a m i no aci d -W ang resin /(mmol #g -1)
0. 560. 610. 510. 56
Reacti on effi ciency(%)
74. 881. 571. 178. 0
从表3数据可以看出, 摇床中的缩合反应效率均低于机械搅拌下的缩合反应效率. 原因是摇床搅拌力度比机械搅拌差. 在固-液两相反应中, 保护氨基酸必须经过膜扩散和粒扩散两个过程才能进入W ang 树脂内部, 与树脂内部的反应基团接触. 搅拌的加强可以提高膜扩散速率, 使机械搅拌的反应效率比摇床中的更高一些.
2. 4 W ang 树脂粒度对缩合反应效率的影响
将2批取代度相同(1. 0mm o l/g)、粒度不同的W ang 树脂分别与两种保护氨基酸在相同条件下反应, 结果见表4.
T ab le 4 E ffect of par ti c le size on react i on efficiency
100) 200M esh
Fm oc -a m i no aci d Fm oc -A s n(T rt)-O H F m oc -Cys(Trt)-OH
Load i ng of Fm oc -a m i no aci d --1
W ang resi n /(mmol #g )
0. 440. 45
Reaction
effi ciency(%)
68. 670. 5
200) 400M esh
Load i ng of Fmoc -a m i no aci d --1W ang resi n /(mm ol #g )
0. 480. 50
Reaction
effi ciency(%)
74. 877. 4
从表4数据可以看出, 粒径越小的树脂连接效率越高. 这是因为相同取代度的W ang 树脂, 其粒径越小, 反应物从外到内扩散的路径越短, 越有利于缩合反应中缩合试剂及保护氨基酸的粒内扩散缩合反应的进行.
[11]
和
3 结 论
本研究结果表明, 相同条件下不同的保护氨基酸与W ang 树脂的缩合反应效率与保护氨基酸的侧链结构有关, 侧链基团越大反应效率越低; 对同一种保护氨基酸而言, W ang 树脂的取代度越高, 树脂粒度越大, 缩合反应效率越低; 加强搅拌可适当提高缩合反应效率. 由于本研究采用了低比例投料量的缩合反应工艺, 主要试剂与W ang 树脂的摩尔比为2. 5B 1, 对肽合成生产的工业化更具有实际意义.
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高等学校化学学报 V o. l 29
参 考 文 献
[1] M errifiel d R . B. . J . Am. Che m. Soc . [J],1963, 85(14):2149) 2154
[2] M iyos h iK. , O t aka A . , Kaneko M. , et al . . C he m. Phar m. Bu l. l [J],2000, 48(8):1230) 1233[3] Barl os K. , G atos D. . B i opoly m er[J],1999, 51(4):266) 278
[4] S tigers K . D . , K outrou li s M. R . , Chung D. M. , et a l . . J . O rg . C he m. [J],2000, 65(12):3858) 3860[5] F i el d s G. B. , N ob l e R. L. . Int . J . Pepti de Protei n Res . [J],1990, 35(3):161) 214
[6] Saran tak i s D . , Teichman J . , L ien E. L. , et a l . . B ioch e m. B i ophys . R es . Co mm un. [J],1976, 73(2):336) 342[7] F i el d s G. B. , F i el d s C. G . . J . Am. Che m. Soc . [J],1991, 113(11):4202) 4207
[8] Z HANG Zh -i Gang(张志刚), HE Su-T i ng(何素婷), HE M i ng -H ua(何明华). Journal of B iol og i calC he m i stry (生物化学杂志) [J ],
1997, 13(2):177) 180
[9] L U Gun -s hen, Svetl an aM ojs on, J a m es P . T a m. J . Org . Ch e m. [J],1981, 46(17):3433) 3436[10] Gude M. , Ryf J . , W h ite D . P . . Pep ti de S ci ence[J],2002, 9:203) 206
[11] M arti n ez J . , Fehrentz J . A. . Pepti des 2000[C],Pari s :Ed itions EDK, 2001:357) 358
Condensati on R eaction of Fm oc -protected Am i no A ci d andW ang Resi n
Z H ENG Yan -H ui , Z HANG Yan-Ping , Z HANG H ao , MA Yu-X i n
1, 21, 2
L U Y an -L i n g , S H I Zuo -Q i n g
(1. T ianjin N ankaiH echeng S &T Co. L t d. ;
2. Colle ge of Che m istry, N ankai Universit y, T i anj i n 300071, China)
1
1
1
1, 2*
,
Abst ract The i n fluence of Fm oc -pr o tected a m ino ac i d , substitution and particle size ofW ang resi n and stir -ring m odes on the condensati o n reaction efficiency o fFm oc -protected a m i n o acid andW ang resi n w ere studied .
It is found t h at the m o lecu lar size of F m oc -protected a m ino acid affected the efficiency of condensation reac -ti o n , the s m a ll the a m ino acid is , the higher the efficiency of condensation reacti o n w ill be ; when the substitu -ti o n ofW ang resi n i s h i g her , Fm oc -pr o tected a m ino acid conjo i n ed before h i n deri n g the later condensation re -acti o n , so that the hindered condensation reaction efficiency decrease . K eywords So li d phase synthesis ; W ang resi n ; Fm oc -protected a m i n o ac i d ; Acti v e ester m ethod
(Ed . :H, J , Z)