QRT-PCR引物设计protocol
QRT-PCR 引物设计
概述:
在QRT-PCR 过程中,由于涉及到模板定量,所以要求引物特异性强,并且不能扩增出基因组DNA (如果用DNA 酶处理干净另当别论),所以要求跨外显子设计(可以不用考虑基因组DNA 污染),或跨内含子设计(检验DNA 酶是否处理干净,即无基因组DNA 污染)。下面是自己在设计过程的一些心得体会,与大家分享之!
要求:
1. 上下游引物的长度一般为18-30bp 之间,且Tm 值在58-62℃之间,上下游引物的Tm 值相差最好不超过2℃。
2. GC=30-80%;
3. 应避免引物中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G 碱基出现。引物的3’端最好不为G 或/和C 。引物3’端的5个碱基不应出现2个G 或/和C 。
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8. PCR 扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp 之间都可;80~150 bp最为合适(可以延长至300 bp); 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在; 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA 污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组DNA 污染的影响; 至于设计软件,PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都可以的; 关于BLAST 的作用应该是通过比对,发现你所设计的这个引物,在已经发现并在GENEBANK 中公开的不物种基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序列之外的序列相同的序列,则可能扩出其他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差,从而不能用;
9. 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构,同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。 设计方案:
I. 跨内含子设计方案(尽量不采用,如果方法II 没有合适的引物,在考虑I )
1. 上下游引物分别在两个外显子上,如下图所示,这样设计的引物可以检验是否有基因组DNA 污染;
FP
II .跨外显子设计方案(尽量采用这种方案设计)
1. 上游(A )或下游(B )或上下游引物(C )跨在两个外显子上,如下图所示,这样设计的引物不能从基因组DNA 扩增, 从而消除基因组DNA 污染的影响(这要求目的基因具有较多的外显子,从而有较多的选择,引物本身质量可能不好,同时注意:引物在两个外显子上分布,在“内侧”要少些,
FP
A
FP RP
B FP RP
C
2. 外显子拼接: 以NM-005101为例,首先把该基因的基因组序列拷入EditSeq 软件,根据外显子位置
指示,按Ctrl+J,弹出如下框,填入78。
按Ctrl+N,弹出一新的序列框,拷贝1~78位碱基到该新序列框中,然后如法炮制,拷贝486~
1041位碱基到该新序列框的1~78后面,即为拼接后的外显子序列,按Ctrl+A,然后按Ctrl+C拷贝该序列到Primer Premier 5软件中,如果有3个以上外显子,也按上述方法拼接起来。
3. 引物设计:拷贝待设计外显子序列到Primer Premier 5后,点击Gentank 框左上角的Primer 按钮,如
下图所示:
然后出现如下引物设计框,点击Search 按钮:
然后出现如下参数设定框,我们根据外显子与内含子的接头位置(78)和引物设计条件,将上游引物限定在55~90之间,将下游引物设定在90~634之间,将引物长度设定在80~150之间,将引物长度设定在24±6。(注:这里要求根据外显子在基因组中的位置计算外显子在mRNA 中位置,以便于填写Search Ranges,如:NM-004335的外显子在基因组中的位置分别为:1~285、1139~1205、1387~1447、1752~1896、2250~2630,则其在mRNA 中的位置:1~285、286~352、353~413、414~558、559~939,这一点尤其重要,且工作量很大)
点击确定,出现确认框,点击OK ,出现如下对话框,每一行代表一对引物,点击引物所在行,即可在引物设计栏中查看该引物的详细情况,按照前面所述引物设计要求选择合适的引物,每个基因设计两对引物。
4. 引物保存:点击Primer Premier 5菜单栏的Edit ,点击Copy ,将上下游引物拷入引物设计结果相应的
位置,如下图所示:
点击菜单栏的File ,点击Print ,Current Pair,将引物设计结果打印成PDF 文件或直接打印出来,以备后续参考。
5. 将设计好的引物在NCBI 进行Blast ,Blast 时,可在上下游引物之间加空格或换行,注意记住上下游
引物的长度,如分别是20bp 和19bp ,然后进行Format ,结果完全出来后,查找有没有和1-20、21-39同时完全匹配的基因(这种一般就是要扩增的基因,如果不是,那么就是非特异性扩增),其他的就不用考虑了。