紫外与荧光实验讲义
实验一 绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数
一. 实验目的
通过紫外吸收光谱的绘制和摩尔吸光系数的测定，掌握Agilent8453 UV-V is 的使用方法。 学习导数光谱计算方法及特点。
二. 实验原理
1．本实验用Agilent8453型分光光度计绘制氨基酸（苯丙氨酸，色氨酸 ）的紫外吸收光谱，找出它的吸收峰波长并计算摩尔吸光系数。
紫外分光光度法是利用物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，波长范围为200-400nm 的紫外光谱。
各种分子都有其特征的吸收光谱，即吸光度与摩尔吸光系数随波长的变化而变化的规律。吸收光谱的形状与物质的特征有关，以此进行定性分析。
为了清楚地描述各种物质对紫外区域电磁辐射的选择性吸收的情况，往往需绘制吸收光谱曲线，即吸光度对波长的曲线。在吸收光谱曲线上可以找到最大吸收峰波长。 根据比尔定律：
A = εb c
式中A —吸光度
ε—摩尔吸光系数
b —液槽厚度，单位：厘米
c —摩尔浓度，单位：mol/l
摩尔吸光系数可按下式计算：
ε=A
b c
实验测得的吸收光谱及摩尔吸光系数与仪器及其狭缝宽度有关。因此实验结果须注明所用仪器的型号及缝宽条件。
2．导数分光光度法：利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。利用导数光谱进行分光光度测定，称为导数分光光度法。通常可以获得1-4阶导数光谱。在各阶导数光谱中，吸光度对波长的微分值与溶液中组分的浓度c 保持线性关系：d A
d λs s ∝c 。其中s 为导数的阶数。因此，可以利用
导数光谱进行定量测定。
导数光谱可用于放大图谱间差别，定性分析中分辨重叠谱带，而且还可以减少定量
分析中来自散射、基体、及其它吸收物的干扰影响。由于导数光谱灵敏度高，因此对于试样纯度检验，多组分混合物的测定，消除共存杂质的干扰和背景吸收，测定混合式样都具有特殊的优越性。
三. 实验仪器和试剂
1. Agilent8453 UV-Vis 分光光度计;
2. 移液枪(德国BRAND 公司生产);
3. 25ml 容量瓶，50ml 容量瓶10支;
4. 氨基酸储备液：色氨酸0.400 g/l，苯丙氨酸2.00 g/l;
5. 去离子水
四. 实验步骤
1. 波长测定
（1）用氨基酸储备液及去离子水在50ml 容量瓶中配置氨基酸溶液，色氨酸浓度为50mg/l, 苯丙氨酸720mg/l；
（2）分别取上述溶液，用1cm 石英比色皿，以水作参比溶液，在波长范围为190nm ——450nm 间测定他们的吸收光谱。
2. 导数光谱：应用软件中的Math 下的Derivate 功能，设置参数，分别计算出两种氨
基酸标准溶液的1阶导数光谱图。
五. 数据处理
1. 以λ为横坐标，A 为纵坐标作出吸收光谱
2．根据ε=A
b c ，先在吸收光谱上找出峰值波长及相应的吸光度，然后计算试液的摩尔
浓度。
3．一阶导数光谱的绘制：对于测量到的一组波长等间隔的吸光度值Y ，可用窗口移动
多项式最小二乘拟合求导法获得对应波长的导数值Y *：
（1） 式中j 为数据序列中的次序(第j 个点) ；C 为卷积系数，为一矢量；N 为归一化因子；
2m +1为窗口宽度；△x 为变量的间隔(这里为波长) ，其上标s 为导数的阶数。计算一阶导数时(s =1)，常用二次多项式进行拟合。则卷积系数C 中第i 个元素为：C ＝i ，(i ＝i
i =m
-m,-m+1,…,m-1,m) 。而归一化系数为N =∑
i =-m i 。 2
例如取m = 3(窗口宽度为7) 时，C ＝（-3，-2，-1，0，1，2，3），N = 28。这样的参数代入式(1)计算所得Y *，即为一阶导数光谱。
要求对测得光谱计算一阶导数光谱，并画图。
六. 讨论与思考
1． 比较导数光谱和吸光度光谱的区别，说明导数光谱的作用。
2． 一阶导数光谱的峰值，对应于原光谱的什么位置？原光谱的峰值所得的一阶导数值
为多少？
实验二. 氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量
一. 实验目的
学习不荧光分析法的基本原理和荧光仪的操作。
二. 实验原理
荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光，激发的完成是由于光的吸收。利用物质被光照射后产生的，能够反映出该物质特性的荧光以进行该物质的定性分析和定量分析，称为荧光分析。
在一定光源强度下，若保持激发波长λex 不变，扫描得到的荧光强度与发射波长 λem 的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持λem 不变，扫描得到的荧光强度与λex 的关系曲线，则称为荧光激发光谱。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光分析的定量基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关。
色氨酸（Try ）、苯丙氨酸（Phe ）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定。两者的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。
三. 实验仪器和试剂
1. LS-55型荧光分光光度计;
2. 移液枪(德国BRAND 公司生产);
3. 50ml 容量瓶，25ml 容量瓶10支;
4. 氨基酸储备液：色氨酸4mg/l，苯丙氨酸100mg/l;
5. PH7.4的KH 2PO 4-K 2HPO 4缓冲溶液
6. 去离子水;
四. 实验步骤
1．打开电脑和光谱仪主机，将仪器预热20分钟左右。设定仪器参数：全波长预扫描参数，用储备液在50ml 容量瓶中配置溶液，各加入缓冲溶液2ml ，加水定溶后，使得色氨酸浓度为0.1mg/l, 苯丙氨酸5mg/l；对两种溶液进行预扫描，并记录扫描结果。同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。
2．从预扫描得到激发和发射波长的初步结果，分别对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。
发射光谱参数：扫描波长范围250—600nm ；Ex=258nm，扫描速度=500 nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=10nm, 扣除空白后记录信息，记住取文件名。
激发光谱参数：扫描波长范围200-400nm ，λem (Phe)=287nm，λem (Try)=357nm, 扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=10nm, 扣除空白后记录信息。
同步荧光光谱：扫描波长范围200-350nm, Δλ(λem -λex )=60nm,扫描速度=500nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=10nm,扣除空白后记录信息。
五．数据处理
1．用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱。
2．从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。
在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。
六．讨论与思考
1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？
2．观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？
3．同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。
4．通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。 CH 22CH 2CHCOOH NH 2
苯丙氨酸 色氨酸
5．比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。
注意事项：
实验报告以电子版的形式发送至[email protected]。也可书面提交。
试验结束后实验数据放置在网上ftp://192.168.17.4可自己下载。