何首乌中二苯乙烯苷提取物的制备工艺及含量测定
何首乌中二苯乙烯苷提取物的制备工艺及含量测定
刘新桥 高文远3 陈海霞
天津大学药物科学与技术学院 天津
何首乌为蓼科植物何首乌Πολψγονυµµυλτιφλο2
ρυµ× ∏ 的干燥块根 具有补肝肾!益精血!乌须发!强筋骨的功效∀现代药理研究表明何首乌具有抗衰老!降低胆固醇!提高免疫功能!防治动脉粥样硬化及保肝等活性≈ ∀二苯乙烯苷是何首乌中重要的活性成分 具有抗氧化清除自由基 降低胆固醇 保肝 减轻脑缺血所致的脑组织损伤等多重功能≈ 2 ∀国际市场对二苯乙烯苷需求较大∀目前 何首乌中二苯乙烯苷的制备工艺有文献报道用乙醇提取 大孔树脂纯化≈ 但其所得产品纯度不够高 而且对大孔树脂吸附工艺未考察完全∀本实验对何首乌中二苯乙烯苷的提取纯化工艺进行了系统的研究 得到了高纯度的产品 并在此基础上建立了提取物中有效成分二苯乙烯苷的含量测定方法 为二苯乙烯苷的制备和质量控制及相关新药开发提供参考∀
1 仪器与试药
高效液相色谱仪日本岛津 ≤ ×∂°单泵
岛津≥°⁄ ∂∂°型紫外可见分光光度检测器
± ≤ 1 ≅ Λ 色谱柱
≥ ≥型电子天平
北京赛多利斯仪器系统有限公司 何首乌药材 购自天津中药饮片厂 由天津大
学药学院高文远教授鉴定 χ2四羟基二苯
≈收稿日期 2 2 ≈通讯作者 3
高文远 × ∞2
∏ ∏
# #
乙烯2 2Ο2Β2∆2葡萄糖苷对照品 ≥ 公司 乙腈为色谱纯 乙醇为分析纯 ⁄ 型大孔树脂 南开大学化工厂
硅胶 ∗ 目 青岛海洋化工厂 ∀2 方法与结果2 1 提取工艺
2 1 1 正交试验设计 采用渗漉法对药材进行提
取
在提取过程中采用正交设计对最佳提取工艺条件进行了选择
根据二苯乙烯苷的理化性质及预试验结果
影响提取效果的主要因素有加水量!浸泡时间!流速等 故以二苯乙烯苷的提取率为指标 按
正交表设计正交实验 其因素水平表见表 ∀表 因素水平
水平
Α
Β
Χ
加水量 倍
浸泡时间 流速 # #
2 1 2 提取方法与结果 按照正交设计方案 分别称取
何首乌药材粗粉 目 共 份 分别加入相应体积的水
浸泡相应时间 渗漉 得渗漉液 加水定容至
分别精密吸取 并称取何首乌药材适量
按2 4中方法分别测定 次渗漉液中二苯乙烯苷的含量和药材中二苯乙烯苷的含量 计算其提取率 提取率 渗漉液中二苯乙烯苷的量
药材中二苯乙烯苷的量 ∀实验结果见表 方差分析见表 ∀
第 卷第 期
年 月
ΧηιναϑουρναλοφΧηινεσεΜατεριαΜεδιχα
中国中药杂志
∂ ∏ ∏
表 正交实验及结果
实验号
提取率
实验号
提取率
1 1 1 1 1 1 1 1
1
表 方差分析表
方差来源
方差平方和
自由度
Φ比Φ临介值显著性Α 1 1 1 显著 Β 1 1 1 不显著Χ
1 1 1 不显著
误差
1
由表 及表 的实验结果并考虑生产成本可知
Α Β Χ 为最佳条件
即 倍量水 浸泡 以每公斤药材 #
的流速渗漉∀
按最佳工艺验证 批 二苯乙烯苷的转移率为
分别为 1 1 1 所以本提取工艺较稳定 且提取率高∀
2 2 大孔树脂纯化
将按最佳条件渗漉所得的渗漉液过大孔树脂进行初步纯化 对大孔树脂的吸附容量和洗脱条件进行了考察 确定了工艺条件∀
2 2 1 吸附容量的确定 绘制透过曲线确定二苯
乙烯苷的吸附容量 取 纯化好的大孔树脂湿法装柱 将渗漉液浓缩至一半体积 取 浓缩液 湿法上样 瓶收集流出液 测定每瓶流出液中二苯乙烯苷的含量 测定方法见2 4 以二苯乙烯苷的含量为纵坐标 以瓶号为横坐标 绘制透过曲线如图 ∀
图 二苯乙烯苷的透过曲线
由透过曲线可知上
样液较好 根据渗漉液中二苯乙烯苷的含量可知最佳上样量为 #
树脂∀
2 2 2 洗脱剂乙醇浓度的确定 绘制洗脱曲线确定洗脱剂的浓度 按上述条件取渗漉液上柱 然后分别以 的水
乙醇洗脱 瓶收集洗脱液 ° ≤测出每瓶中
二苯乙烯苷的量 以二苯乙烯苷的含量为纵坐标 以瓶号为横坐标
绘制洗脱曲线如图 ∀图 二苯乙烯苷的洗脱曲线
洗脱曲线显示
二苯乙烯苷主要集中在 的乙醇洗脱液中!
占全部乙醇洗脱液中二苯乙烯苷的 左右 而 乙醇基本未洗下二苯乙烯苷 故确定洗脱条件为先用 乙醇洗去水溶性杂质 再用 乙醇洗脱二苯乙烯苷 收集 乙醇洗脱部分∀
2 2 3 乙醇用量的确定 取
大孔树脂 湿法装 根柱 每根 取 每根柱
渗漉液上样 然后分别以 倍量大孔树脂体积的 乙醇洗脱 测得洗脱率分别为 1
1 1
综合考虑回收成本和洗脱效果 倍量乙醇是较好的洗脱体积∀
2 3 硅胶柱纯化
将过大孔树脂后所得洗脱液减压回收溶剂 真空干燥 取 粉末用硅胶按 Β 拌样 将相当于粉
末 倍量的硅胶装柱 干法上样 用醋酸乙酯2甲
醇2水 Β Β 以 #
的流速进行洗脱 按每份 进行收集 洗脱体积为 1 个柱体积
弃去前 1 个柱体积的洗脱剂 收集后 个体积的洗脱剂 回收 干燥得何首乌二苯乙烯苷提取物产品∀
综上所述 何首乌中二苯乙烯苷的制备工艺流程为何首乌药材粗粉 目 加 倍量水 浸泡
以每公斤药材 #
的流速渗漉 渗漉液上大孔树脂柱 倍树脂体积 乙醇洗脱 洗脱液回收溶剂 干燥 干法上硅胶柱 以醋酸乙酯2甲醇2水 Β Β 洗脱∀回收溶剂 干燥得产品∀
2 4 何首乌提取物中二苯乙烯苷的含量测定2 4 1 色谱条件 ±2 ≤ 色谱柱 1 ≅
Λ
流动相乙腈2水 Β 检测波长 流速 1 #
柱温 ε∀在上述条件下二苯乙烯苷达到基线分离 见图 ∀
# #
第 卷第 期
年 月
ΧηιναϑουρναλοφΧηινεσεΜατεριαΜεδιχα
中国中药杂志
∂ ∏ ∏
图 何首乌提取物 ° ≤图
对照品 提取物 二苯乙烯苷2 4 2 标准曲线的制备 精密称取 1
χ2
四羟基二苯乙烯2 2Ο2Β2∆2葡萄糖苷对照品置
量瓶中 用 乙醇溶解并定容 摇匀 用 1 Λ 微孔滤膜滤过
得对照品溶液 精密吸取对照品溶液 1 1 1 1 1 Λ 进样 测定峰
面积 计算色谱峰面积 Ψ 与样品量 Ξ 的回归方程为Ψ Ξ ρ 1
线性范围 1 ∗ 1 Λ ∀
2 4 3 精密度 精密吸取对照品溶液 Λ 重复进样 次
测定峰面积 计算得其 ≥⁄为 1 ∀2 4 4 重复性 精密称取同一批样品 份 置
量瓶中 用 乙醇溶解并定容 摇匀 1 Λ 微孔滤膜滤过 进样 Λ
测定峰面积 计算得其 ≥⁄为 1 ∀
2 4 5 稳定性 精密称取样品 1
置 量瓶中 用 乙醇溶解并定容 摇匀 1 Λ 微
孔滤膜滤过
每 测定 次 测定 次 测定峰面积 结果 ≥⁄为 1 在 内稳定性良好∀
2 4 6 加样回收率 精密称取同一批样品 份 置
量瓶中 精密加入标准品 用 乙醇溶解并定容 摇匀 1 Λ 微孔滤膜滤过 分别进样
Λ
测定峰面积 结果见表 ∀表 二苯乙烯苷加样回收率
称样量
加入量
测得量
回收率
平均值
≥⁄ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1
1
1
2 4 7 样品的含量测定 精密称取 批样品 置
量瓶中 用 乙醇溶解并定容 摇匀 1 Λ 微孔滤膜滤过 分别进样 Λ 测定峰面积∀计算含量分别 1 1 1 平均含量 1 ∀
3 讨论# #
文献报道二苯乙烯苷的提取方法多采用醇提法≈ 而本工艺采用水提法 因为在后续的精制工艺中要用大孔树脂
而用大孔树脂纯化二苯乙烯苷时用水作溶媒上样有利于二苯乙烯苷的吸附 用醇提后需要将乙醇回收完全 用水提则可以直接上样 而且实验表明水提时二苯乙烯苷的转移率可达
左右
基本与醇提相同∀另外 二苯乙烯苷受热后不稳定≈ 故采用渗漉法∀
有文献报道用大孔树脂纯化二苯乙烯苷的工艺≈ 其采用醇提液浓缩后上样 这可能导致在浓缩时二苯乙烯苷析出损失 且乙醇未回收完全则会降低大孔树脂对二苯乙烯苷的吸附容量∀该文也未对动态吸附容量进行考察
对吸附条件未考察完全 本文对动态吸附进行了研究 得出了最佳上样量∀另外 该文在绘制洗脱出线时采用紫外可见分光光度法测定二苯乙烯苷含量 这可能导致所绘洗脱曲线不准确 因为其它杂质会对二苯乙烯苷的测定结果产生干扰 本文用高效液相色谱法来测定各瓶洗脱液中二苯乙烯苷含量 准确描绘出了洗脱规律∀
先用大孔树脂对粗提物初步精制 除去了大部分糖类等水溶性杂质及脂溶性杂质 然后上硅胶柱纯化时样品量较少且较纯 有利于节约成本并得到高纯度的二苯乙烯苷∀
制备所得二苯乙烯苷纯度高 总提取率高于
工艺安全 重复性较好∀≈参考文献
≈ 李玉芳 和玄华 何首乌现代研究进展≈
中成药
≈ 刘厚淳
陈万生 何首乌水溶性成分 χ2四羟基二苯乙烯2 2Ο2Β2∆葡萄糖苷的体外抗氧化作用研究≈ 药学实践杂志
≈
∏ ≠ ∞ ° ∏ √ ∏ ¬ 2 ≈ °
≈ 刘治军
李 林 叶翠飞 等 二苯乙烯苷对脑缺血啮齿动物脑 ⁄ 受体及细胞内钙离子的影响≈ 中国药理学通报
≈ 朱丽霞
宁喜斌 郭春玉 大孔树脂纯化何首乌中二苯乙烯苷的工艺研究≈
食品科学 ≈ 吕丽爽 汤 坚 何首乌中二苯乙烯苷的醇提工艺≈
食品与发酵工业
≈ 张 纯
杨少麟 高效液相色谱法测定何首乌中二苯乙烯甙的含量及其稳定性考察≈
中国中药杂志 ≈责任编辑 鲍 雷