细胞色素P450表达在植物防御反应中的作用

第22卷　增刊2004年7月

石河子大学学报(自然科学版) Journal of Shihezi University (Natural Science )

Vol . 22　Sup .

Jul . 2004

文章编号:1007-7383(2004) zk -0184-04

细胞色素P450表达在植物防御反应中的作用

戴素明

1, 2＊

, 周程爱

1, 2＊

, 谢丙炎

1＊＊

, 冯东昕, 肖启明

12

(1中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京100081; 2湖南农业大学植物保护学院, 长沙410128)

摘要:细胞色素P450是广泛存在植物体中的一种多功能氧化酶, 它在植物对病原侵袭的防御反应中起着重要的作用。本文从植物P450的多样性, 及在寄主-病原物不亲和互作中的特异表达, 证明了P450参与植物的抗病反应; 同时, 分析P450在植物抗病反应的作用途径, 说明P450在植物抗病基因工程中存在巨大的应用潜力。关键词:植物抗病性; 细胞色素P450; 防御反应; 不亲和互作中图分类号:Q559+. 9　　　　文献标识码:A 　　　　

　　细胞色素P450是一类以还原态与CO 结合后在波长450nm 处有吸收峰的含血红色素的多功能氧化酶。自从1958年首次发现以来, 近年来, 每年发

表的有关P450的文章已超过2000篇。研究证实, P450不仅在动物、微生物体内存在, 在植物体中也广泛存在。随着分子生物技术不断发展, 已从111种植物中获得1052个植物细胞色素P450基因, 部分P450基因功能已得到鉴定。P450在植物体中担当着生物合成和代谢解毒2大类型功能, 其中有一些P450在植物防御反应中具有重要的作用。本文重点对有关参与植物抗病性的P450的研究情况作一综述。

保护植物组织免遭外界恶劣环境、病原物等因素的危害。反过来, 根据动植物“交战”(animal -plant war -fare ) 假说, 植物为了适应自然的选择, 需不断地进化来抵抗外界不利因素, 从而推动了P450的多样性发展。

2　P450在寄主-病原物互作中的表达

　　部分P450是从寄主-病原物互作中分离得到的, 如从茄科植物分离的4个P450基因(表1) 。这些P450基因在不亲和互作的寄主中特异表达或优先表达, 且活性很高; 而在亲和互作中不表达或微弱表达, 说明P450在寄主-病原物互作中起着重要的作用。其中, CYP71D19通过原位杂交实验和果实解剖分析, 其产物在病菌侵染果实表皮时起保护作用。CYP92A2是烟草发生过敏性反应的相关基因(Hsr515) 。

表1　在茄科-病原物互作中表达的P 450

细胞色素Genbank P450

E MBL 编号

寄主

病　原　物

参考文献[2]

[3]

1　P450基因多样性与植物的抗病性

　　植物P450通过基因重复和保守进化形成一类庞大的超基因家族, 数量远甚于起源共同祖先的动物、真菌P450, 如:已从拟南芥中获得272个P450(包括26个假基因) ; 已克隆的植物P450按照国际P450命名法规定, 分属于51类P450家族。从已鉴定的基因功能来看, P450可以催化许多次级代谢反应, 已知的催化反应已超过50种, 反应底物包括脂类、苯丙烷类、黄酮类、萜类、生物碱、生氰糖苷等内源性化合物以及包括农药、除草剂等在内的外源物质。涉及的反应机制有羟基化、环氧化、杂原子脱烷基、双键氧化、杂原子氧化等。P450这种在基因结构和功能的多样性, 正是响应植物抗病性的需求, 使原地不动的植物获得复杂多样的化学体系, 从而

-[1]

CYP71D19AF122821辣椒C olletotric hum gloeospori oides

CYP73A18Z70216番茄Botrytis ciner ea

CYP82E1AB015762烟草Ps eu domonas syringae [4]

pv . glycinea

CYP92A2X95342烟草Ps eu domonas so lanacearum [5]

3　P450在植物抗病反应的作用途径

在植物与病原物的长期进化过程中, 植物细胞色素P450可以通过各种代谢途径在体内形成各种

增刊　　　　　　　　　　　戴素明, 等:细胞色素P450表达在植物防御反应中的作用　　　　　　　　　　　　　　185

抗病原物有关的物质。它们有的作为毒素或杀虫剂, 提高植物对病原物、昆虫等的抗性; 有的则作为胁迫信号(stress signals ) , 活化植物的抗病性。

多合成生氰糖苷的植物(如Sorghum bicolor 、Triglochin maritima ) 中, 分离到催化酪氨酸变成生氰糖苷中间体的N -羟化酶基因, 其属于CYP79家族。N -羟化酶活性也已在体外得到表达。参与蜀黍氰苷(Sor -ghum bicolor 中主要的生氰糖苷) 生物合成的另1个P450基因也已获得, 命名为CYP71E1。在植物的生

长过程中, CYP79A1和CYP71E1是蜀黍氰苷生物合成的关键酶。CYP79A1活性始终低于CYP71E1, 表明CYP79A1催化蜀黍氰苷生物合成的限速步骤

[13]

[12]

3. 1　结构抗病有关物质的合成

细胞木质化是植物进行细胞壁成分修饰的1种方式, 起到防止病原体生长的作用。已发现催化木质素合成的1种关键酶肉桂酸-4-羟化酶是P450(CYP73) 。CYP73的时空表达特性与该酶在木质化过程中的功能相一致。其活性还受病虫害和逆境的诱导。CYP94A1作为ω-油酸羟化酶, 其酶活性已在体外得到证实。CYP94A1催化油酸(C18) 的羟基化, 合成植物角质层的组成成分18-hydroxy -9, 10-ep -oxystearic 和9, 10, 18-trihydroxystearic acids , 使植物增强了抵抗病原物进一步侵染的能力。另外, CYP94A1的产物还是植物与病原物互作的信使物[7]

质。树脂是巨冷杉(Abies grandis ) 防御昆虫侵害的主要的机制。催化其合成的酶有2种是P450(枞酸二烯羟化酶和枞酸二烯醇羟化酶) , 二者的活性可

[1]

因受伤而高度诱导。

[6]

。

丁布(DIMB OA ) 是禾本科植物一类次生代谢物氧肟酸中的1种。早已发现许多禾本科植物特别是玉米, 对多种病虫, 如欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis (H ǜbner ) 、亚洲玉米螟O . farnacalis (Guen é) 、玉米小斑病菌Helminthosparium turcicum Pass 的抗性与丁布有关。已从玉米和小麦中分离得到介导丁布合成的P450基因, 它们都属于CYP71C 亚家族。玉米的4个P450(CYP71C1-CYP71C4) 参与丁布合成的4个连续的羟化反应

[15]

[14]

。

3. 4　信号分子的合成

Oxylipin 是一类生物活性物质, 在植物生长和抗病过程中发挥信号功能, 且有些还直接具有杀菌活性。它由脂肪酶和脂加氧酶催化衍生的脂肪氢过氧化物, 经不同代谢途径而形成。通过cDNA 序列比较等分析, 分别参与3条代谢途径的酶AOS (丙二烯氧化物合酶) 、HPL (氢过氧化物裂解酶) 、DES (divinyl ether synthase ) 是P450。研究发现, 它们分属于CYP74的三类亚家族, 即CYP74A 、B 和D 。AOS 、HPL 和DES 通过不同代谢途径(图1) , 共同作用于植物的抗病反应。

3. 4. 1　AOS 途径　该代谢途径已通过拟南芥缺失突变体得到证实, CYP74A 催化茉莉酸(JA ) 的合[16]

成。由于底物量的限制, CYP74A 在正常植株的过量表达并不能提高茉莉酸的基本水平。但是, 植株经伤口处理后, CYP74A 的过量表达则能引起茉莉酸过早过量的积累, 说明AOS 的过量表达可能是控制高等植物抗病动力学的1种途径

[17]

3. 2　植保素的合成

植保素是由寄主植物和病原物2个代谢系统相互作用产生的能抑制对植物有致病作用的微生物生长的一类小分子抗菌物质。至今已在17科植物中, 发现并鉴定了200种植保素。其中, 5, 7, 45-三羟基异黄酮(genistein ) 是豆科植物合成植保素的前体物质。它由异黄酮合酶(isoflavone synthase ) 催化4′, 5, 7-三羟基黄酮烷(naringenin ) 而形成。已发现异黄酮合酶是P450, 其编码基因已从许多豆科植物中获得, 如紫花苜蓿、豌豆等; 其活性也已在酵母细胞中得到证实。异黄酮合酶基因能在植物所有组织部

[9]

位中表达, 且能被谷胱苷肽、紫外线正向调控。甜椒素是茄科植物中重要的萜类植保素。现已从纤维素酶处理的烟草悬浮细胞中克隆获得CYP71D20, 其酶活性已在体外证实:CYP71D20催化5-epi -aris -[10]tolochene 和1-deoxycapsidiol 形成甜椒素。从拟南芥突变体PAD3中, 获得催化合成植保素ca malexin 的PAD3基因(PAD3基因与P450的同源性很高, D . Nelson 命名为CYP71B15) 。CYP71B15能使拟南芥抗Alternaria brassicicola , 但不影响植株对Pseudo -monas syringae 的抗性

[11]

[8]

。

3. 4. 2　HPL 途径　该途径与AOS 途径催化的底物

都是13-氢过氧化脂肪酸, 但是合成的产物不同。CYP74B 催化合成创伤激素、挥发性的乙醛和醇。这些产物可以影响昆虫的生殖力, 及作为植物的创伤

[18]

信号。CYP74B 对植物抗病性的重要影响已通过反义基因技术实验得到证实。转HPL 反义基因的马铃薯植株, 其表型和伤口诱导表达基因没有发生, , 。

3. 3　有毒物质的合成

生氰糖苷在2650多种植物中发现, 当组织受伤时, 生氰糖苷分解为糖、酮或醛以及氰化氢, 从而使

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(186自然科学版) 　　　　　　　　　　　　　　　　第22卷

能力增强, 进而也表明HPL 途径能使植物获得对吸吮(sucking ) 昆虫的持久抗性

[20～21]

[19]

因活性:从烟草毛状腺分离的具有羟化酶活性的P450(CYP71D16) , 在运用反义和共抑制技术鉴定其功能时, 发现CYP71D16催化的底物(cembratrieneol ) 明显增加, 使得植株避免了蚜虫的侵染。最近,

已获得CYP71D16的启动子, 可调控植株产生新的分泌物, 提高植物的抗病能力

[29]

[28]

。另外, 研究报道:外

源茉莉酸甲脂(MJA ) 能促进Oxylipin 通过HPL 途径合成, 而不形成茉莉酸。

3. 4. 3　DES 途径　这是最近报道的P450参与的另1条Oxylipin 合成途径。CYP74D 以9-氢过氧化脂肪酸为底物, 催化合成Divinyl ethers 。关于Divinyl ethers 在植物体的功能还不十分清楚。最近报道:CYP74D 催化产物在马铃薯抗疫病中起着重要作用

[22]

。随着研究的不断

深入和科技水平的不断提高, 将来会有更多P450的基因得到鉴定, 将为植物提供更广阔的抗病资源。参考文献:

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。CYP74D 主要在植物的根组织中表达

[23]

。但

是, 在Pseudomonas syringae 和Phytophthora infestans

处理的叶组织中也能够检测到CYP74D 的活性

[24, 25]

。

Allene Oxides (丙二烯氧化物) 、Cyclopentenones (环戊烯酮) 、Oxo -acids (烯酸) 、Aldehydes (醛) 、

Divinyl Ethers (二乙烯醚) 图1　Qxylipin 生物合成途径

4　结语

分子生物学技术的发展加速了人们对细胞色素P450的认识, 植物P450基因的分离和功能鉴定, 揭示了细胞色素P450在植物抗病物质合成中的作用。现在已有许多关于应用P450提高植物抗病性的研究, 证明P450应用植物抗病工程的巨大潜力, 如:1) 引进外源代谢途径:非豆科类的拟南芥植株, 经转入异黄酮合酶基因后, 能在体内积累5, 7, 45-三羟基异黄酮

[26]

; 催化生氰糖苷合成的3个酶基因

(CYP79A1、CYP71E1和UGT85B ) 转入拟南芥中, 获得的转基因植株在生理表型和适应性上没有发生变化, 但是, 植株能合成新的天然产物(生氰糖苷) , 获ne [27]

增刊　　　　　　　　　　　戴素明, 等:细胞色素P450表达在植物防御反应中的作用　　　　　　　　　　　　　　187[12]Nielsen J S , Moller B L . Cloning and expression of cytochrome

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Role of Cytochromes P450Expression in Plant Defence Responding to Pathogens

DAI Su -ming

1, 2

, ZhOU Cheng -ai

1, 2

, XIE Bing -yan , FENG Dong -xin , XIAO Qi -ming

112

(1Institute of Vegetables and Flowers , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081china ;

2College of Plant Protection , Hunan Agricultural University , Changsha Hunan 410128china ) A bstract :Cytoc hr omes P450for m the lar gest family of plant pr oteins . It plays very important role in defending disease of plants . In this paper , we review that P450impr ove plant defence a gainst insects and pathogens by the discuss of the di -verse of P450and the special expr ession of P450in host -pathogen incompatible interaction . Meanwhile , the ways of P450to improve plant protection was analyzed . The paper showed that the potential of P450for plant disease resistance engi -neering . Key words :plant disease resisstance ; Cytochromes P450; defence response ; incompatible interaction