酶的定向进化
酶的定向进化
关键词：酶 氨基酸 蛋白质 试剂 标准物质 北京标准物质网
一、概念及一般步骤
定点诱变方法在蛋白质工程中起到了至关重要的作用。然而，定点诱变只能对天然蛋白质序列中的部分单独氨基酸进行替换或修改，因而对其生物活性提高的作用有限。同时，该方法仅适用于三维结构明确、结构与功能的相互关系也清楚的蛋白质，应用空间相对有限。这些定向诱变技术本身的局限性制约了其更为快速的发展和更广泛的应用。 酶的定向进化技术，则是在不了解酶的空间结构和作用机制的情况下，通过人为创造特殊条件模拟自然进化过程，在体外使其基因发生大量变异，并定向筛选获得具有特定性质或功能的突变酶分子。相对于传统的定点诱变蛋白质理性设计方法，定向进化被称为蛋白质的非理性设计方法。
酶的定向进化技术一般步骤为：选择已经存在的酶分子作为进化起点，确立目标酶的性质或功能；通过随机突变和基因体外重组创建基因突变文库；确定目标酶分子的筛选方法；选择结果相对最好的突变株。通常，酶的定向进化是一个循环递进的过程，以一次循环所得的最佳突变株作为下一个突变循环起点，逐渐累积正突变直至获得期望的目标酶分子。
酶的定向进化技术是一种更接近自然进化方式的蛋白质工程新策略，使原本在自然界中需要数千万年的进化过程缩短至几个月内完成，并能定向得到符合需要的新型酶分子，大大加速了蛋白质工程的发展。目前，蛋白质的合理设计策略与酶分子的定向进化方法互相补充，为研究蛋白质的结构和功能开辟了新的道路，拓宽了蛋白质工程的研究范围和应用前景。
二、定向进化的研究方法
定向进化一般包括随机诱变、体外重组、筛选鉴定三部分，每一部分都有多种研究技术。
1. 随机诱变 易错PCR 技术是通过改变传统PCR 方法的反应条件，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，进而构建突变基因库。该方法多用于较小的基因片段，其遗传变化只发生在单一分子内部，属无性进化范畴。由于在突变过程中有益突变的概率很低，因此该方法较为费力耗时。一般易错PCR 过程均需要连续反复进行使得每一次的正向突变累积直至产生重要的有益突变。
此外，人们还发展了化学诱变剂介导的随机诱变和致突变菌株产生随机突变等随机诱变方法。
2. 体外重组 DNA 重组技术是将一组序列相关的DNA 序列随机切成多重片段，在不加引物的情况下进行多次PCR 循环，在该扩增过程中上述随机片段互为引物和模板进行扩增至完全基因。此后，再加入两端引物进行常规PCR 诱变，获得含多种基因的突变基因库。该方法尽可能多地组合目的基因中的不同突变，从而导致更大的变异，有助于累积发现有益突变，比易错PCR 技术更有针对性。
此外，交错延伸重组、随机引物体外重组、临时模板随机嵌合生长等诸多改组方法也已得到成功运用。
3. 筛选鉴定 在酶分子的定向进化中，由于突变是随机产生的，因此建立—个灵敏高效的方法筛选特定方向的突变，可以限定定向进化的方向，大大提高酶分子向特定方向进化的效率。建立有效的筛选方法对突变体库进行筛选是决定定向进化是否成功的关键。通常筛选方法的建立要综合考虑产物特性和检测方法等以有效地确定最佳突变。目前常用的筛选方法包括：使用荧光或显色反应、改变培养条件、高通量筛选等。总体来讲，筛选方法的发展趋势是在高灵敏高通量的基础上向高效率自动化方向发展。