高效液相色谱法测定丙戊酸钠的血药浓度

·药物研究·Drug Identification

China Pharmaceuticals

2013年6月20日第22卷第12期

Vol．22，No．12，June20，2013

高效液相色谱法测定丙戊酸钠的血药浓度

胡

琳

310014）

（浙江省人民医院，浙江杭州

摘要：目的建立测定血清中丙戊酸(VPA ) 血药浓度的高效液相色谱法。方法血清用正己烷提取，环己烷羧α－溴苯乙酮为衍生试剂，

酸为内标，采用Zorbbx SB C 18柱(250mm ˑ 4．6mm ，检测波长为248nm ，流速5μm ) 为分析柱; 流动相为甲醇－水(79ʒ 21，V /V ) ，为1．0mL /min ，设计个体化给药方案。结果内标环己烷羧酸和丙戊酸的保留时间分别为6．3min 和9．3min ，质量浓度线性范围为

平均回收率为99．98%，日内、日间RSD 均小于5．66%。结论该法快速、简单、准确性好，适用于临床12．5 200μg /mL (r =0．9999) ，进行丙戊酸的血药浓度监测。

关键词：高效液相色谱法; 丙戊酸; 血药浓度; 个体化给药

中图分类号：R969．1；R969．3；R971+．6

文献标识码：A

Hu Lin

（Zhejiang Provincial People s Hospital ，Hangzhou ，Zhejiang ，China

310014）

文章编号：1006－4931(2013) 12－0016－03

HPLC Method for Determination of Sodium Valproate Serum Concentration

Abstract ：Objective

To establish the HPLC method for the serum concentration determination of valproic acid （VPA ）and to guide the

individualized medication regimen by analying the typical cases ．Methods

Serum was extracted with hexane．With α－bromoacetophenone

as the derivative reagent and cyclohexane carboxylic acid as the internal standard ，the Zorbbx SB －C 18column （250mm ˑ 4．6mm ，5μm ）was adopted as the analytical column ；the mobile phase was methanol －water （79ʒ 21，V /V ），the detection wave length was set at 248nm ，

the flow rate was 1．0mL /min．The above mentioned method was used to determine the dozens of cases using sodium valproate．From them ，3typical cases were selected for discussing the influencing factors of the serum sodium valproate concentration and designing the individualized drug administration regimen ．Results The retention time of internal standard cyclohexane carboxy acid and VPA was 6．3min

the linear range was 12．5－200μg /mL ，the ratio of the sodium valproate peak height and the internal stan-and 9．3min respectively ，

dard peak height showed good linear relation with the concentration （r =0．9999）．The average recovery rate was 99．98%，RSD of in-during the process of the practical measurement of serum drug con-tra －day and inter －day was less than 5．66%．At the same time ，centrations ，it was founded that the same dosage of sodium valproate could produce a larger gap of the blood drug concentration in dif-simple ，accurate and suitable for serum sodium valproate concentration monitor-ferent individuals ．Conclusion This method is rapid ，ing．In order to adjust the individualized dosing regimen ，the serum sodium valproate concentration monitoring is necessary．Key words ：HPLC ；valproic acid ；blood drug concentration ；individualized drug administration

丙戊酸为临床抗癫痫的第一线药物，有效血药浓度为50 当血药浓度高于100μg /mL 时，毒副作用增加而疗100μg /mL ，

效无明显增加，常见不良反应有恶心、呕吐、肥胖、脱发、血小板减其体内过程和疗效个体差异较大，导致剂量与少和肝功能损害。

为最大限度地发挥疗效和避免不血药浓度之间的相关性较差[1]。

间的相互作用。在缺氧缺血状态下，外源性神经节苷脂可通过患儿血脑屏障进入大脑，嵌入神经细胞膜，发挥保护神经细胞不受损伤的作用；可防止细胞内钙积聚，提高Na +－K +－ATP 酶活性，清除受损细胞释放的过量自由基，维持细胞内外离子的平衡。大量研究表明，神经节苷脂在手足口病缺氧缺血状态时，可促进神经组织的再修复，减少兴奋性氨基酸的释放，从而减轻细胞毒性和血管水肿，促进神经功能恢复[10]。

综上所述，在常规治疗的基础上加用脑细胞保护剂神经节苷脂，可提高临床有效率，改善退热时间、精神状态恢复时间和呕吐停止时间，值得临床推广。参考文献：

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良反应，因此在长期用药或增减药物剂量时对体内血药浓度进行近年来，有关丙戊酸血药浓度监测的文献报监测显得十分必要。

道较多，有气相色谱法[2]、荧光偏振免疫法[3]、散射免疫比浊抑制高效液相色谱法[5－7]等。笔者建立了以α－溴苯乙酮为柱前法[4]、

衍生化试剂，能快速简便测定丙戊酸血药浓度的高效液相色谱

山西中医，2010，26(12) :33．

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檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨

(收稿日期：2012－11－26)

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（HPLC ）法，适用于临床血药浓度监测和药动学的研究，同时为指导个体化给药方案提供了理论依据。现报道如下。1

仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；小型三用水箱（北京医疗设备厂）；SZ －1型快速混匀器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；TGL －18G －C 型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；分析天平（江阴县天平仪器厂）。甲醇为色谱纯（Merck 公司），正己烷、硫酸、乙腈、氨水、三乙胺均为分析纯；环己烷羧酸（中国药品生物制品检定所）；丙戊酸（中国药品生物制品检定所）；α－溴苯乙酮（Fluka 公司）；灭菌注射用水（莎普爱思）。22．1

方法与结果色谱条件

后，取20μL 进样，分析测定，然后以标准液质量浓度(Y ) 为纵坐

标、丙戊酸与内标峰比值(X ) 为横坐标，作回归处理，得回归方程结果表明，丙戊酸在2．5 Y =37．362X －0．2766，r =0．9999。4．0μg /mL 范围内呈良好的线性关系。

精密度试验：在加内标的空白血清中加入丙戊酸标准液适量，分别配置成200，100，50，25，12．5μg /mL 5个质量浓度的样品，在同1天内测定，计算日内精密度；每天测1次，连续测定

计算日间精密度。结果日内、日间的RSD 均小于5．66%。5d ，

回收率试验：在加内标的空白血清中加入丙戊酸标准液适按拟订方法量，配置成200，50，12．5μg /mL 的丙戊酸血清样品，操作，记录峰面积，由标准曲线求出各点的浓度，与已知加入浓度结果见表1。相比，计算回收率。

表1

200．050．012．5

回收率试验结果(n =3)

回收率(%)

99．87103．9896．08

99．98

3．954

(%)

RSD (%)

色谱柱：Zorbbs SB C 18柱（250mm ˑ 4．6mm ，5μm ）；柱温：40ħ ；

流动相ʒ 甲醇－水（79ʒ 21）；流速：1．0mL /min；检测波长：248nm ；内标：环己烷羧酸；定量方法：峰面积内标法。2．2

溶液配制

精密称取丙戊酸100mg ，置50mL 容量瓶中，用0．2mol /L 氨水稀释至刻度，得质量浓度为2g /L 的标准溶液。精密吸取上述标准液一定量，用0．2mol /L 氨水配成200，100，50，25，精密吸取环己烷羧酸50μL ，12．5μg /mL 的丙戊酸系列标准液。

用0．2mol /L 氨水稀释至刻度，再精密吸取置50mL 容量瓶中，

该液7．5mL 至50mL 容量瓶中，用0．5mol /L 氨水稀释至刻度，

得质量浓度154．5μg /mL 的环己烷羧酸内标液。精密称取α－溴苯乙酮1．0g ，置100mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，即得衍生试剂。2．3

血样处理与色谱行为

精密吸取空白血清0．05mL 共5份，加入丙戊酸标准液

分别加内标液0．05mL 和1mol /L 硫酸0．1mL ，混匀。0．05mL ，

加正己烷2mL ，振荡提取5min 后，以10000r /min 的速度离心1min 。精密吸取上清液1mL ，加α－溴苯乙酮和三乙胺

在50ħ 水浴中衍生10min ，氮气流吹干，用甲醇各0．05mL ，

取20μL 进样。高效液相色谱图见图1，色谱0．1mL 溶解残渣，

峰分离较好，完全达到基线分离。

1

加入量(μg /mL ) 测得量(μg /mL )

199．7451．9912．01

专一性试验：考虑到临床上合用药物有可能对本试验的结果有干扰，在拟订色谱条件下，对几种可能合用的药物卡马西平、苯地西泮、硝西泮、苯巴比妥进行分析。结果这几种药物均妥因钠、

不出峰，对本法测定无干扰，不会影响丙戊酸血药浓度的测定。稳定性试验：将标准液及其他相关溶液存放于2 10ħ 的冰

箱中，分别于第1，3，5，7，10，14d 时用200，50，12．5μg /mL 标准液配置测定液，进行质量浓度测定。结果血清中标准液含量未发生明显变化，说明贮备液在14d 内稳定性良好。3

讨论

据报道，以甲醇－水（75ʒ 25）为流动相，结果显示溶剂峰太高，样品峰太小[8－9]；而以甲醇－水（79ʒ 21）为流动相，内标环己烷羧酸和丙戊酸钠峰形较好，分离完全。

丙戊酸分子结构中不含有紫外特征吸收基团，难以用高效液在碱性条件下，将其连接上有紫外吸收的基相色谱法直接测定。

团是本法的关键。本法采用α－溴苯乙酮为衍生化试剂，在三乙胺的催化下，反应完全彻底，基线稳定，可以用HPLC 法测定，流动相不需要使用缓冲液等盐类物质，有利于保护色谱柱，并且衍对衍生化反应及测定结果生试剂在冰箱中冷藏保存6个月以上，无影响。

通过丙戊酸钠血药浓度的监测同时结合特殊案例，发现小于体内血药浓度差异很大，而且3岁患儿口服同样剂量丙戊酸钠，用药依从性差，不具有语言表达能力，机体发育又不成熟，药物对高于其造成的损害会更大，因此更有必要加强血药浓度的监测。可能是因为老年人体65岁患者血清丙戊酸浓度监测数据较少，

蛋白结合率低，故使用同等剂量的药物在体内内蛋白含量较低、

的游离药物量较高，药物剂量调节更易，癫痫病情控制更佳，医生因此，选择一种或患者认为没有必要进行血清丙戊酸浓度监测。

不良反应少、疗效高的治疗方案对于保障生命非常重要。

作者简介：胡琳（1984－），女，浙江杭州人，大学本科，初级药（电话）0571－87312094（电子信箱）huLinchrist1@126．com 。师，参考文献：

[1]李金恒．临床治疗药物监测的方法和应用[M ]．北京:人民卫生出版

社，2003:40．

[2]马虹英，李新中．气相色谱法测定血浆中丙戊酸浓度的方法改[J ]．

2

t /min

6

7

8

9

1．环己烷羧酸(内标)

图1

2．丙戊酸

高效液相色谱图

2．4样品处理

将血样以6000r /min 离心4min ，取上清液0．1mL ，加内标

混匀，加正己烷2mL ，振荡液0．05mL 和1mol /L 硫酸0．1mL ，

提取5min 后，以10000r /min 的速度离心2min ，精密吸取上清液1mL ，加α－溴苯乙酮和三乙胺各0．05mL ，在50ħ 水浴中衍生10min ，氮气流吹干，用甲醇0．1mL 溶解残渣，取10μL 进样。2．5

方法学考察

标准曲线绘制：精密吸取空白血清0．05mL ，加入丙戊5份，酸系列标准液0．05mL （200，分别加内100，50，25，12．5μg /mL ），标液0．05mL 和1mol /L 硫酸0．1mL ，混匀。然后拟订方法处理

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2013年6月20日第22卷第12期

Vol．22，No．12，June20，2013

Stevens －Johnson 综合征患者卡马西平的血药浓度测定＊

蔡

（1．中国人民解放军第458医院药剂科，广东广州

茁1，郭

510602；

丹2

广东广州2．南方医科大学南方医院药学部，

510515）

摘要：目的采用高效液相色谱法测定Stevens －Johnson 综合征患者血清中卡马西平的质量浓度。方法血清样品采用甲醇和二氯甲烷萃取后进样测定，以VP －ODS C 18柱(250mm ˑ 4．6mm ，以甲醇－水(15ʒ 85) 为流动相，检测波长为240nm ，流速为5μm ) 为色谱柱，结果卡马西平质量浓度在4 20μg /mL 范围内与峰面积呈良好线性关系，低、中、高质量浓度的平1．0mL /min 。r =0．9991(n =5) ，均相对回收率分别为103．12%，结论该方法简单、结果准确、灵敏度高，可为临床监测卡马西平不良反103．77%，101．69%(n =5) 。应提供科学依据。

关键词：Stevens －Johnson 综合征; 卡马西平; 高效液相色谱法

中图分类号：R969．1；R969．3；R971+．6

文献标识码：A Cai Zhuo 1，Guo Dan 2

（1．Department of Pharmacy ，458Hospital of PLA ，Guangzhou ，Guangdong ，China

510602；

Medical University ，Guangzhou ，Guangdong ，China

2．Department of Pharmacy ，Southern Hospital ，Southern

510515）

文章编号：1006－4931(2013) 12－0018－02

Determination of Blood Concentration of Carbamazepine in Stevens －Johnson Syndrome by HPLC

Abstract ：Objective To adopt the HPLC method to determine the serum concentration of carbamazepine in Stevens －Johnson syn-

drome ．Methods The serum samples were extracted with methanol and dichloromethane for conducting the sample determination．The VP －ODS －C 18（250mm ˑ 4．6mm ，5μm ）was taken as the chromatographic column ，the mobile phase was composed of methanol －water （15ʒ 85）with a flow rate of 1．0mL /min．The detection wavelength was set at 240nm ．Results The linear range of carbamazepine was 4 20mg /mL （r =0．9991，n =5），the relative average recovery rates were 103．12%，103．77%and 101．69%，respective-ly ．Conclusion This method is simple with accurate result and high sensitivity ，which can provide the scientific basis for mastering the adverse reactions of carbamazepine in clinic．

Key words ：Stevens －Johnson syndrome ；carbamazepine ；HPLC 卡马西平为癫痫精神运动性发作的首选药，其引起重症药疹

[1]

史蒂文斯－约翰逊（Stevens －Johnson ，在临床上多有报道。SJS ）综合征为一种严重的药疹，红斑性大疱广泛散布，口腔、眼部及咽部等处黏膜糜烂，唇红缘溃烂结痂，同时伴有高热、头痛、关节痛等全身症状。经常有药物致Stevens －Johnson 的报道，尤其以卡马西平致Stevens －Johnson 综合征的报道最多[2]，但未见此类患者卡马西平血药浓度测定的报道。笔者建立了测定Stevens －Johnson

综合征患者血清中卡马西平浓度的高效液相色谱（HPLC ）法，为临床监测卡马西平不良反应提供了科学依据。1

仪器与试药

惠普HP －1050型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵，DAD 检测器，卡马西平对照品（中国药品生HP －1100型自动进样器。物制品检定所）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。22．1

方法与结果色谱条件

柱温：40ħ ；进样量：10μL 。2．2

血清样品处理

精密量取患者血清样品0．4mL ，置

加入20μL 甲醇，于5mL 的离心试管中，

旋涡仪中混合均匀。吸取400μL 的甲醇，加入上述血清中混匀，再加入二氯甲烷振荡2min ，以3000r /min 的速度2mL ，

取下层有机相，氮气吹干，用流离心5min ，

动相100μL 复溶，以3000r /min的速度

离心10min ，取上清液进样分析。2．3

方法学考察

专属性考察：将空白血清、空白血清加对照品、患者血清标本按拟订方法处理

2

4

6

8

t /min

2

4

6

8

A

1

t /min

2

4

6

81

t /min

B

色谱柱：Shimadzu VP －ODS C 18柱（250mm ˑ 4．6mm ，5μm ）；

流动相：甲醇－水（15ʒ 85）；检测波长：240nm ；流速：1．0mL /min；

项目编号:2010－KZ －34。＊广州市白云区科技计划项目，

色谱图见图1。在该色谱条后进样测定。

A．空白血清

件下，卡马西平的保留时间为5．82min 。B．空白血清+对照品

标准曲线绘制：准确称取干燥至恒C．血清样品重的卡马西平对照品20mg ，精密称定，图1

高效液相色谱图

C

1．卡马西平

檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨

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(收稿日期：2012－07－03)

18